清瀉濁毒方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)制研究※

姜 萍 王占奎

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科教研室，山東 濟(jì)南 250355)

實(shí)驗(yàn)研究

清瀉濁毒方治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的機(jī)制研究※

姜 萍 王占奎△

(山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)內(nèi)科教研室，山東 濟(jì)南 250355)

目的觀察清瀉濁毒法對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的作用，并探討其機(jī)制。方法將40只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組，每組10只?？瞻捉M、模型組每日灌胃0.9%氯化鈉注射液2mL，清瀉濁毒方組灌胃清瀉濁毒方藥液2mL，吲哚美辛組灌胃吲哚美辛腸溶片藥液2mL，連續(xù)4d。模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組大鼠采用尿酸鈉混懸液注入大鼠踝關(guān)節(jié)腔造成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型；空白組注入0.9%氯化鈉注射液對(duì)照。造模后按原方案繼續(xù)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3d。觀察比較各組大鼠造模前及造模72h后的體質(zhì)量、步態(tài)變化及末次灌胃1 h后關(guān)節(jié)組織中的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3)水平含量。結(jié)果造模72h后較造模前僅空白組體質(zhì)量明顯增加(P<0.01)，但從體質(zhì)量增減程度比較，清瀉濁毒方組分別與模型組及吲哚美辛組比較體質(zhì)量增加明顯(P<0.01)；造模72h后較造模前模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組步態(tài)分級(jí)情況與正常組比較均有明顯改變(P<0.01)，清瀉濁毒方組及吲哚美辛組步態(tài)分級(jí)情況與模型組比較有明顯改善(P<0.01)，且2組效果相當(dāng)(P>0.05)；模型組大鼠末次灌胃1 h后關(guān)節(jié)組織MMP-3水平較空白組比較明顯增加(P<0.01)，清瀉濁毒方組及吲哚美辛組與模型組比較MMP-3水平均有下降趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論清瀉濁毒方能夠明顯改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)步態(tài)和整體功能，且胃腸道副作用小，其作用機(jī)制與降低MMP-3水平無(wú)明顯相關(guān)。

關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性；祛邪；疾病模型，動(dòng)物；大鼠；中醫(yī)療法

近年來，痛風(fēng)的發(fā)病率呈逐年遞增、年輕化趨勢(shì)，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是其主要表現(xiàn)形式，目前控制其發(fā)作的主要藥物有秋水仙堿、非甾體抗炎藥及激素等，雖然緩解癥狀較快，但停藥后容易復(fù)發(fā)且副作用明顯，限制了其臨床應(yīng)用[1]。中醫(yī)藥治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效顯著，毒副作用較小，已越來越受到關(guān)注。周翠英教授認(rèn)為急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病機(jī)為“濕熱濁毒流注，積聚關(guān)節(jié)而發(fā)”[2]，我們總結(jié)歷代醫(yī)家及多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，以清瀉濁毒法為治法，反復(fù)篩選藥物，擬定清瀉濁毒方為基礎(chǔ)方治療，療效顯著。本實(shí)驗(yàn)擬觀察清瀉濁毒方對(duì)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型的影響，探討其作用機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(200±22) g，由山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(魯20090001)。

1.1.2 藥品及試劑 中藥清瀉濁毒方(藥物組成：金銀花20g，蒲公英30g，土茯苓30g，熟大黃15g)，由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室煎煮濃縮成含生藥1.71 g/mL的溶液；吲哚美辛腸溶片(山西云鵬制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H14020771，批號(hào)A090902)，配制成濃度為0.50mg/mL的混懸液，均置入4℃冰箱冷藏備用；尿酸鈉(美國(guó)SIGMA公司，批號(hào)120K535)，取0.2g尿酸鈉加入4mL 0.9%氯化鈉注射液，配制成5%的尿酸鈉混懸液備用；基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-3)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒(美國(guó)R&D Systems公司，批號(hào)BP-E69605R)。

1.1.3 儀器 AV2101電子分析天平，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；DT5-3臺(tái)式離心機(jī)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司；REX-C400電熱恒溫水浴箱，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；雷杜RT6000酶標(biāo)儀和雷杜RT3000洗板機(jī)，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司；AU2700型全自動(dòng)生化分析儀，日本OLYMPUS公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 全部40只大鼠適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表達(dá)法分為：空白組、模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組，每組10只?？瞻捉M、模型組每日灌胃0.9%氯化鈉注射液2mL，清瀉濁毒方組灌胃清瀉濁毒方藥液2mL，吲哚美辛組灌胃吲哚美辛腸溶片藥液2mL，連續(xù)4d。

1.2.2 造模方法 模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組大鼠采用4號(hào)注射器將50μL尿酸鈉混懸液注入大鼠踝關(guān)節(jié)腔，造成急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型；空白組注入0.9%氯化鈉注射液50μL。造模后按原方案繼續(xù)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)3d。

1.3 觀察指標(biāo)及方法

1.3.1 對(duì)體質(zhì)量的影響 分別觀察測(cè)量各組大鼠造模前及造模72h后的體質(zhì)量變化，觀察藥物對(duì)大鼠胃腸功能的影響。

1.3.2 對(duì)步態(tài)變化的影響 參照Coderre的步態(tài)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ級(jí)[3]，觀察造模72h后各組大鼠步態(tài)變化，記錄每組中異常步態(tài)的大鼠數(shù)目。

1.3.3 對(duì)關(guān)節(jié)組織MMP-3含量的影響 末次灌胃1 h后，各組大鼠采用脫頸椎處死，按相關(guān)文獻(xiàn)方法[4-5]，在右踝關(guān)節(jié)上0.5cm處剪斷，切開受試關(guān)節(jié)囊，用1 mL 0.9%氯化鈉注射液灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液，然后用銳利刀片切取少量關(guān)節(jié)囊、滑膜等周圍軟組織，制成勻漿，與關(guān)節(jié)沖洗液同用3000r/min離心，取上清液，采用MMP-3酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒測(cè)定MMP-3的含量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠造模前及造模72h后體質(zhì)量的變化 見表1。

組 別n造模前造模后72h體質(zhì)量增減空白組10213．80±12．78232．2±14．67?17．00±5．14模型組10213．80±11．45214．4±13．7950．60±5．68△清瀉濁毒方組10210．58±8．78220．75±13．7611．67±9．93吲哚美辛組10216．10±4．58212．20±10．08-2．90±9．37△

與本組造模前比較，*P<0.01；與清瀉濁毒方組比較，△P<0.01

由表1可見，造模72h后，空白組、模型組及清瀉濁毒方組大鼠體質(zhì)量增加，吲哚美辛組大鼠體質(zhì)量減少，但僅空白組較造模前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其余均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但從體質(zhì)量增減程度比較，清瀉濁毒方組分別與模型組及吲哚美辛組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，清瀉濁毒方組體質(zhì)量增加明顯。

2.2 各組大鼠造模72h后步態(tài)分級(jí)情況比較 見表2。

表2 各組大鼠造模72h后步態(tài)分級(jí)情況比較 只

經(jīng)過Ridit分析，模型組、清瀉濁毒方組及吲哚美辛組步態(tài)分級(jí)情況與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，均有明顯改變；清瀉濁毒方組及吲哚美辛組步態(tài)分級(jí)情況與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且2組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明2組均可改善大鼠步態(tài)，且療效相當(dāng)。

2.3.3 各組大鼠末次灌胃1 h后關(guān)節(jié)組織MMP-3水平情況比較 見表3。

組 別空白組(n=10)模型組(n=10)清瀉濁毒方組(n=10)吲哚美辛組(n=10)MMP-322．99±2．9226．95±4．66?26．36±4．3923．64±3．37

與空白組比較，*P<0.01

由表3可見，模型組大鼠末次灌胃1 h后關(guān)節(jié)組織MMP-3水平與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，明顯增加；清瀉濁毒方組及吲哚美辛組與模型組比較，MMP-3水平均有下降趨勢(shì)，但比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

痛風(fēng)屬中醫(yī)痹證范疇，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痛風(fēng)發(fā)生的病因主要為風(fēng)、濕、熱、痰、瘀、虛、毒7種，對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的認(rèn)識(shí)也從單純外感，到內(nèi)外合邪，或者臟腑內(nèi)生熱毒直接流入關(guān)節(jié)發(fā)病。我們認(rèn)為，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的病機(jī)為臟腑積熱蘊(yùn)毒，外因誘發(fā)，致濕熱濁毒流注于骨節(jié)而發(fā)病，故以清瀉濁毒為治法。清瀉濁毒方中金銀花甘寒清芳，性偏宣散，既能瀉臟腑之熱，又能清解經(jīng)絡(luò)之毒，清熱解毒而不傷陰，芳香透達(dá)而不蘊(yùn)邪，配伍性寒味苦的蒲公英增強(qiáng)清熱解毒、散結(jié)消腫之力，且能散滯氣，利尿消腫，久用不傷脾胃，是痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎首選的清熱解毒藥；土茯苓性味甘淡平，既能利濕除熱去積毒，又能消腫通絡(luò)利關(guān)節(jié)，大劑量應(yīng)用善消關(guān)節(jié)腫脹而無(wú)傷陰之弊；大黃苦寒，瀉下攻積，清熱瀉火，涼血解毒，逐瘀通經(jīng)。二者配伍，土茯苓清熱解毒、通利小便，熟大黃清熱解毒、通腑瀉熱，使?jié)岫倦S二便泄下，清泄骨節(jié)中濁毒，祛除絡(luò)中濁瘀而止痛。綜觀全方，選用金銀花配伍蒲公英，清解熱毒之力倍增而不傷陰；土茯苓聯(lián)合熟大黃，使?jié)岫緩拇笮”愣?，清熱解毒與瀉下相互配伍，相使為用，相得益彰。我們前期的研究表明，清瀉濁毒方有明顯的臨床療效，其能夠增加高尿酸血癥大鼠的24h尿量、尿液尿酸濃度，增加24h尿酸的排泄[6]，從而達(dá)到治療作用。

MMP-3是由滑膜細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞分泌，它作用底物廣泛，具有降解膠原蛋白、蛋白多糖、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等成分的能力。近年來研究發(fā)現(xiàn)，MMP-3在炎癥反應(yīng)中占重要地位，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)滑液中MMP-3濃度高于非炎性關(guān)節(jié)疾病，可作為反映關(guān)節(jié)滑膜炎癥的指標(biāo)之一[7]。踝關(guān)節(jié)注射尿酸鈉后，關(guān)節(jié)液中的MMP-3均有不同程度的增加，經(jīng)過清瀉濁毒方和吲哚美辛灌胃后，關(guān)節(jié)液中的MMP-3濃度與模型組比較均有下降，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后無(wú)顯著性差異，說明清瀉濁毒方和吲哚美辛對(duì)模型大鼠關(guān)節(jié)液中升高的MMP-3水平改善不明顯。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，清瀉濁毒方能夠明顯改善急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)步態(tài)和整體功能，且胃腸道副作用小，對(duì)大鼠的消化吸收沒有明顯影響，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)滑液中的MMP-3濃度有一定的降低作用，但不明顯，說明其作用機(jī)制與降低MMP-3水平無(wú)明顯相關(guān)，可能與療程和樣本數(shù)量有關(guān)，也可能存在其他作用機(jī)制，有待進(jìn)一步探討。

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(本文編輯：石 康)

Mechanismresearchofaprescriptionforclearingturbidandpoisononacutegoutyarthritisrats

JIANGPing,WANGZhankui.

TraditionalChineseMedicineInternalMedicineDepartment,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shandong,Jinan250355

ObjectiveTo research the mechanism of a prescription for clearing turbid and poison on acute gouty arthritis rats.Methods40Wistar rats were randomly divided into blank group, model group, a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group, 10rats in each group. Rats in blank group and model group

0.9% sodium chloride injection 2mL, once a day. Rats in a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group received a prescription for clearing turbid and poison and Indometacin Enteric-coated Tablets soup 2mL, once a day for four day. Acute gouty arthritis model rats in a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group were established by sodium urate suspension injected into the cavity ankle of rats. Rats in blank group and model group received the cavity ankle injection of 0.9% sodium chloride. After modeling the original program continued gavage once daily, continuous 3d. Comparison of body mass were observed before modeling and 72h after modeling, gait changes and joint tissue matrix metalloproteinase (MMP-3) levels of content 1 h after the last administration were observed.ResultsBody mass 72h after modeling was increased significantly only in blank group compared with that before modeling (P<0.01). Compare the degree of change in body weight from, body mass 72h after modeling in a prescription for clearing turbid and poison group was increased significantly compared with that in model group and indometacin group (P<0.01). Gait classification situation a prescription for clearing turbid and poison group and indometacin group were obviously improved in comparison with that in model group (P<0.01). Joint tissue MMP-3levels of content 1 h after the last administration in model group were increased compared with those in blank group (P<0.01). There was no significant difference between three groups on tissue MMP-3levels (P>0.05).ConclusionA prescription for clearing turbid and poison can significantly improve gait and the overall function of acute gouty arthritis rats, and gastrointestinal side effects is small, its action mechanism is not obviously associated with lowering levels of MMP - 3.

Arthritis, Gouty; Eliminating evil; Disease models, Animal; Rats; Traditional Chinese medicine therapy

※ 項(xiàng)目來源：山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃資助項(xiàng)目(編號(hào)：J12LK11)；全國(guó)名老中醫(yī)藥專家周翠英傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目

姜萍(1973—)，女，副主任醫(yī)師，副教授，博士。從事中醫(yī)風(fēng)濕免疫病的臨床及實(shí)驗(yàn)研究。

R289.61；R684.3

A

1002-2619(2014)07-1071-03

2013-07-11)

△ 通訊作者：山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕科，山東 濟(jì)南 250011