高效液相色譜法測(cè)定心舒寧片中葛根素的含量

劉素文

(河北省唐山市豐南區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，河北 豐南 063300)

高效液相色譜法測(cè)定心舒寧片中葛根素的含量

劉素文

(河北省唐山市豐南區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，河北 豐南 063300)

色譜法，高壓液相；回收率；葛根；片劑；葛根素

心舒寧片臨床主要作用為活血化瘀，用于心脈瘀阻所致的胸痹、心痛、冠心病、心絞痛、冠狀動(dòng)脈供血不全、動(dòng)脈硬化見上述證候者。是由葛根、銀杏葉等6味中藥材組成，其法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)衛(wèi)生部頒藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑第17冊(cè))WS3-B-3153-98標(biāo)準(zhǔn)，此標(biāo)準(zhǔn)無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)，而葛根中所含葛根素是其主要有效成分。測(cè)定處方中的有效成分葛根素的含量對(duì)臨床合理用藥具有指導(dǎo)意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀：包括Series Ⅲ液相色譜泵(美國(guó)SSI公司)； Model 500檢測(cè)器(美國(guó)SSI公司)；ANASTAR色譜工作站(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；色譜柱：Diamonsil C18，(5μm，4.6mm×250mm)；十萬(wàn)分之一分析天平(METTLER T0LED0公司)； TU-1810型紫外分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 藥品及試劑 心舒寧片(廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z44022796)，葛根素對(duì)照品(含量測(cè)定用，中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110752-200209)，乙腈色譜純(天津四友化學(xué)試劑廠)，磷酸為分析純，水為二次重蒸水。

2 方法

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取葛根素對(duì)照品溶液，用紫外分光光度計(jì)在190～370nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸收度，繪制曲線，對(duì)照品溶液在250nm處有較大吸收，故選用250nm為其測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 流動(dòng)相一：流動(dòng)相為甲醇-水(25∶75)，結(jié)果：葛根素峰與其他組分峰完全分離，但峰形不好，而且出峰時(shí)間太長(zhǎng)。流動(dòng)相二：參照文獻(xiàn)[1]，流動(dòng)相為乙腈-水-磷酸(12∶88∶0.2)，結(jié)果：葛根素峰與其他組分峰不能完全分離。流動(dòng)相三：調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，最終確定流動(dòng)相定為乙腈-水-磷酸(11∶89∶0.2)。

2.1.3 系統(tǒng)耐用性 不同高效液相色譜儀之間的耐用性，儀器：島津，泵(LC-10ATvp)，檢測(cè)器(SPD-10AVP)。結(jié)果：葛根素峰與其他峰分離良好，保留時(shí)間適宜。

流速有微小改變耐用性:把流速由1.0mL/min調(diào)到0.95mL/min，結(jié)果葛根素峰與其他峰分離良好，保留時(shí)間適宜。

色譜柱的變動(dòng)：換用另一根色譜柱(Hypersil C18，5μm，4.6mm×250mm)，結(jié)果葛根素峰與其他峰分離良好，保留時(shí)間適宜。

2.1.4 結(jié)論 經(jīng)試驗(yàn)，該系統(tǒng)在不同儀器、流速微小改變及不同色譜柱的情況下系統(tǒng)耐用性好。確定的色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Diamonsil C18，5μm，4.6mm×250mm)，以乙腈-水-磷酸(11∶89∶0.2)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：250nm；流速：1.0mL/min。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 提取溶劑的選擇 分別以30%乙醇、乙醇作為提取溶劑，比較如下：取心舒寧片內(nèi)容物適量，研細(xì)，稱取2份，每份約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加入30%乙醇溶液、乙醇各50mL，稱質(zhì)量，分別超聲提取30min，放至室溫，稱質(zhì)量，分別用30%乙醇溶液、乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。葛根素對(duì)照品溶液的濃度為0.040mg/mL，分別精密量取20μL，按擬定的色譜條件測(cè)定。結(jié)論：用30%乙醇作為提取溶劑，對(duì)本品中葛根素的提取效果較好，故選擇30%乙醇作為提取溶劑。

2.2.2 提取時(shí)間的選擇 分別以20min、30min、40min超聲提取，比較如下：取心舒寧片適量，研細(xì)，取約0.2g，稱取3份，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，各加入30%乙醇50mL，稱質(zhì)量，分別超聲提取20min、30min、40min，放至室溫，稱質(zhì)量，加30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液即得。葛根素對(duì)照品溶液的濃度為0.040mg/mL，分別精密量取20μL，按擬定的色譜條件測(cè)定，結(jié)果表明，20min同30min與40min提取葛根素有明顯差異，而30min與40min提取葛根素?zé)o明顯差異，為了節(jié)能省耗，將提取時(shí)間定為30min。

2.2.3 方法 取供試品心舒寧片20片，研細(xì)，取約0.2g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入30%乙醇50mL，稱質(zhì)量，超聲處理30min，放至室溫，加30%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取葛根素對(duì)照品12.5mg，置25mL容量瓶中，用30%乙醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取2mL置25mL量瓶中，用30%乙醇稀釋至刻度，即得0.040mg/mL對(duì)照品溶液。

2.4 測(cè)定方法 分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.5 陰性對(duì)照溶液的制備及干擾情況 按處方比例稱取除葛根以外的其余藥味，做成缺葛根的陰性樣品，按上述2.2方法同法制成缺葛根的陰性對(duì)照溶液，精密量取陰性對(duì)照溶液20μL，進(jìn)樣，觀察陰性對(duì)照溶液在葛根素峰的保留時(shí)間處是否有雜質(zhì)峰。

2.6 線性關(guān)系考察 取濃度為0.020、0.030、0.040、0.050、0.060mg/mL的葛根素對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20μL，按擬定的色譜條件測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，葛根素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程。

2.7 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，按2.4項(xiàng)下重復(fù)進(jìn)樣測(cè)定，用測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)反應(yīng)測(cè)定結(jié)果的精密度。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 將同一供試品溶液于室溫下放置，每間隔2h按2.4項(xiàng)下進(jìn)樣，記錄葛根素峰面積，考察樣品溶液的穩(wěn)定性，計(jì)算RSD。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品制成5份供試品溶液，依次按2.4項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定，用測(cè)定值的RSD反應(yīng)測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性。

2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，取已知含量的心舒寧片，稱取約0.1 g，精密稱取6份，分別精密添加已配制好的葛根素對(duì)照品溶液(0.080mg/mL)10mL，按2.2項(xiàng)下的方法制成供試品溶液。按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，回收率(%)=[(實(shí)測(cè)葛根素含量-樣品原有葛根素含量)/添加葛根素含量]×100%。

2.11 樣品含量測(cè)定 對(duì)本品10批樣品中葛根素的含量進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié) 果

3.1 線性關(guān)系考察 以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，葛根素進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程：Y=1 991 495X-7 070R2=0.9999。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素濃度在0.02～0.06mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

3.2 陰性對(duì)照品溶液的干擾情況 在葛根素峰保留時(shí)間處無(wú)雜質(zhì)峰干擾(見圖1～3)。

圖1 缺葛根的心舒寧片陰性樣品色譜圖

圖2 心舒寧片供試品色譜圖

圖3 葛根素對(duì)照品色譜圖

3.3 精密度試驗(yàn) 葛根素RSD=1.9%，表明儀器的精密度良好。見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 葛根素RSD=1.6%，表明供試品溶液至少在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 葛根素RSD=0.8%，表明重復(fù)性良好。見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 回收率試驗(yàn) 葛根素平均回收率=100.30%，RSD=0.47%，表明回收率良好。見表5。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.7 樣品含量測(cè)定 通過對(duì)10批樣品含量的測(cè)定可知，平均每片含量在1.8 mg以上，考慮到原料藥材本身含量的變化及生產(chǎn)中的波動(dòng)，即暫定本品每片含葛根以葛根素(C20H21O9)不得低于1.0mg。見表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討 論

本研究為心舒寧片質(zhì)量研究的一部分，通過對(duì)色譜條件、系統(tǒng)耐用性、陰性干擾情況、線性關(guān)系考察、精密度試驗(yàn)、溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、加樣回收試驗(yàn)及心舒寧片樣品實(shí)際含量測(cè)定表明，用高效液相色譜法測(cè)定心舒寧片中葛根素的含量方法簡(jiǎn)便可行，從而為心舒寧片中葛根素的含量控制提供了理論依據(jù)和方法基礎(chǔ)。

[1] 梁永康，熊龍花.反相高效液相色譜法測(cè)定通脈口服液中葛根素的含量[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，16(4):40-41.

(本文編輯：李珊珊)

劉素文(1963—)，女，副主任中藥師。研究方向：中藥制劑。

R284．1

A

1002-2619(2014)07-1068-03

2013-04-11)