BAPTA-AM脂質(zhì)體抗大鼠急性腎損傷作用

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(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310014)

急性腎損傷(Acute kidney injury，AKI)是由各種原因引起腎功能在短時(shí)間內(nèi)急劇惡化，水、電解質(zhì)及酸堿平衡失調(diào)，患者出現(xiàn)少尿甚至無尿及急性尿毒癥等癥狀的臨床綜合征.目前臨床上尚無明顯降低其高死亡率的臨床藥物和治療方案，臨床上盡管有包括腎移植在內(nèi)的支持療法，但是AKI的病死率依然高達(dá)60%[1-2].AKI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，誘因諸多，如腎小管上皮細(xì)胞凋亡、腎小管功能障礙、局部微血管血液流動(dòng)障礙等[3-4].細(xì)胞內(nèi)Ca2+失衡是造成AKI的重要因素之一[5-6].體外研究表明：夾緊腎蒂45 min引起腎臟缺血會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣攝取減少，細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致線粒體損傷，合成ATP能力受損，快速引起細(xì)胞死亡[7-8].若大量的腎小管上皮細(xì)胞死亡，將引起腎小管阻塞，AKI發(fā)生.BAPTA-AM一種快速高效的細(xì)胞內(nèi)Ca2+絡(luò)合劑，一旦進(jìn)入細(xì)胞可以水解成BAPTA，從而與Ca2+發(fā)生一系列復(fù)雜的反應(yīng)，控制細(xì)胞內(nèi)鈣水平，消除鈣超載，對(duì)鈣超載、氧化引起的細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用[9].宋必衛(wèi)課題組已發(fā)現(xiàn)：BAPTA-AM能減輕D-氨基半乳糖(D-GalN)誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞損傷及對(duì)多種損傷細(xì)胞均有保護(hù)作用[10-13].因此，本研究通過建立大鼠實(shí)驗(yàn)性缺血性AKI模型，觀察BAPTA-AM脂質(zhì)體(BA-L)抗AKI作用及機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

BA-L由合肥恒星科技公司提供；肌酐試劑盒(Cr,批號(hào)20130524)、尿素氮試劑盒(BUN,批號(hào)20130510)、乳酸脫氫酶試劑盒(LDH,批號(hào)20130710)、丙二醛試劑盒(MDA,批號(hào)20130421)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD,批號(hào)20130523)、考馬斯亮藍(lán)試劑盒(批號(hào)20130416)均購自南京建成生物工程研究所；大鼠胱抑素C檢測試劑盒(Cys C,批號(hào)20130620TY)購自上海朗頓生物技術(shù)有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性健康清潔級(jí)SD大鼠，體重200～220 g，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：scxk(浙)20080033.

1.3 分組與給藥

大鼠隨機(jī)分為正常組，假手術(shù)組，模型組，BA-L 3個(gè)劑量給藥組(劑量分別為50，100，200 μg/kg)每組8只.再灌注開始后立即尾靜脈注射相應(yīng)劑量BA-L，與此同時(shí)正常組、假手術(shù)組和模型組分別給予等量生理鹽水.

1.4 大鼠急性腎損傷模型的制備

實(shí)驗(yàn)前大鼠禁食12 h，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，沿腹正中線縱切口打開腹腔，暴露左右兩腎，分離腎動(dòng)、靜脈及輸尿管，用無創(chuàng)動(dòng)脈鉗夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈，腎臟顏色由鮮紅轉(zhuǎn)為蒼白或暗紅色，45 min后松開動(dòng)脈鉗恢復(fù)灌注，10 min內(nèi)腎臟再變成鮮紅色，表明急性腎損傷模型建立成功，否則剔出實(shí)驗(yàn)[14-15]，檢查創(chuàng)面無出血現(xiàn)象后逐層縫合關(guān)閉腹腔，假手術(shù)組僅分離但不夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈.

1.5 大鼠血液和組織樣本的采集

再灌注24 h后，腹腔注射水合氯醛麻醉大鼠，頸總動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清分裝保存，用于檢測血清Cr,BUN,Cys C,LDH水平.取血后立即取左腎，置于冰鹽水中，洗凈表面血液，取腎組織上極以PBS為介質(zhì)制備10%組織勻漿，用于檢測組織MDA含量和SOD活性.

1.6 腎臟病理學(xué)改變

取相同部位腎組織，10%福爾馬林溶液固定至少24 h，常規(guī)石蠟包埋，制成厚度為4 μm的切片，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，HE染色，400倍光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變，隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野選擇10個(gè)腎小管進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)Paller’s法計(jì)算50個(gè)腎小管得分，用于評(píng)價(jià)腎小管損傷程度(得分越高損傷越嚴(yán)重)[16]：腎小管明顯擴(kuò)張、細(xì)胞扁平(1分)；間質(zhì)水腫(1分)；刷狀緣脫落分級(jí)(1分)；細(xì)胞質(zhì)空泡形成(1分)；細(xì)胞膜泡的形成(2分)；腎小管腔梗阻(2分).

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)用Mean±S.E.M表示，實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用One-way ANOVA檢驗(yàn)均數(shù)差異顯著性，以P<0.05為差異有顯著性意義.

2 結(jié) 果

2.1 BA-L對(duì)AKI大鼠血液生化指標(biāo)的影響

血清Cr，BUN，Cys C和LDH水平見圖1.假手術(shù)組與正常對(duì)照組相比各指標(biāo)均無顯著性差異.模型組血清Cr顯著升高(P<0.001)，提示腎小球功能損傷顯著.不同劑量BA-L治療組可降低血清Cr水平(P<0.001).同樣地，模型組血清BUN水平明顯增加(P<0.001)，而BA-L呈劑量依賴性降低血清BUN水平，當(dāng)BA-L劑量為100 μg/kg效果最佳(P<0.01)，進(jìn)一步增大劑量至200 μg/kg時(shí)作用減弱.Cys C是半胱氨酸蛋白酶抑制劑之一，它是由所有有核生物以恒定速率產(chǎn)生.最近的研究表明，血清Cys C能比Cr更敏感且快速地檢測急性腎功能改變[17].模型組血清Cys C水平急劇升高(P<0.001)，給予50 μg/kg BA-L治療時(shí)Cys C水平有一定程度的降低(P<0.05)，進(jìn)一步增大劑量(100和200 μg/kg)可顯著降低Cys C水平(P<0.001).LDH是細(xì)胞破裂的非特異性標(biāo)志物，已證明其在AKI再灌注過程中釋放[18]，是腎壞死的指標(biāo).與對(duì)照組比較，模型組LDH水平顯著提高(P<0.001)，各劑量BA-L治療組能顯著抑制LDH釋放(P<0.001).綜上所述，100 μg/kg時(shí)BA-L效果最佳，加大劑量藥效反而減弱，提示BA-L治療存在最適劑量.

與正常對(duì)照組相比，###為P<0.001；與模型組相比，*為P<0.05,***為P<0.001

2.2 BA-L減輕AKI大鼠腎組織氧化損傷

腎組織MDA含量和SOD活性見表1.模型組SOD活性明顯降低(P<0.001)，同時(shí)MDA含量顯著增加(P<0.001).給予BA-L治療時(shí)能明顯改善腎功能水平，顯著降低MDA含量(P<0.001)，恢復(fù)SOD活性.當(dāng)BA-L劑量過低(50 μg/kg)或過高(200 μg/kg)作用均減弱.結(jié)果表明：BA-L可能是部分通過抗氧化損傷從而發(fā)揮了保護(hù)腎臟的作用，并且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性.

表1 BA-L對(duì)AKI大鼠腎組織氧化損傷、Paller’s法評(píng)分結(jié)果的影響1)

2.3 BA-L改善AKI大鼠腎臟病理學(xué)變化

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取BA-L 100 μg/kg組進(jìn)行HE染色，光鏡下400倍觀察大鼠腎臟病理學(xué)變化(圖2).正常組和假手術(shù)組腎組織形態(tài)完整(圖2a，b)，而模型組大鼠腎組織出現(xiàn)嚴(yán)重的急性腎小管損傷(圖2c)，腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞腫脹核固縮以及中度至重度的壞死.BA-L治療組腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，腎小管細(xì)胞輕度水腫(圖2d).Paller’s法評(píng)分(表1)表明：模型組得分與對(duì)照組相比明顯增高，腎小管損傷程度嚴(yán)重；而BA-L治療組得分較模型組顯著降低，腎小管損傷減輕.

圖2 BA-L改善AKI大鼠腎臟病理學(xué)變化

3 討 論

腎臟缺血再灌注(I/R)引起的AKI在臨床上十分常見，臨床上多種原因均可導(dǎo)致急性腎缺血再灌注損傷，如腎移植、心跳驟停、休克、嚴(yán)重感染等，目前尚無有效的治療方法.I/R引起的AKI以腎功能障礙，腎小管、腎小球損傷，腎小管細(xì)胞凋亡為其主要病理特征.細(xì)胞內(nèi)鈣超載是導(dǎo)致缺血性AKI的重要觸發(fā)點(diǎn)之一.BAPTA-AM是易滲透入細(xì)胞的Ca2+螯合劑，一旦進(jìn)入細(xì)胞，可以通過脂肪酶水解成BAPTA，從而控制細(xì)胞內(nèi)鈣水平，消除鈣超載.本課題組前期已證實(shí)該藥對(duì)D-GlaN誘導(dǎo)的MDCK細(xì)胞損傷有較強(qiáng)的抵抗作用，顯著減少細(xì)胞死亡[10].在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)建立急性腎缺血再灌注損傷模型，進(jìn)一步探討B(tài)APTA-AM抗AKI的作用.

腎臟是機(jī)體重要的排泄器官，機(jī)體Cr，BUN等新陳代謝產(chǎn)生的絕大部分代謝終產(chǎn)物經(jīng)血液進(jìn)入腎臟，由腎小球?yàn)V過或腎小管分泌，隨尿液排出體外.AKI時(shí)，腎功能發(fā)生障礙，表現(xiàn)出Cr和BUN等含量顯著增加.本實(shí)驗(yàn)中，正常對(duì)照組與假手術(shù)組腎功能指標(biāo)(血清Cr，BUN，LDH，Cys C)及氧化應(yīng)激損傷，組織形態(tài)學(xué)特征和凋亡情況幾乎沒有異常，說明本次實(shí)驗(yàn)整個(gè)開腹分離過程對(duì)腎臟并未構(gòu)成任何損傷.AKI模型組Cr，BUN，Cys C，LDH含量急劇增加，表明發(fā)生腎功能障礙，嚴(yán)重的氧化損傷及形態(tài)學(xué)特征改變，呈現(xiàn)了大量的細(xì)胞死亡.與此同時(shí)形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)腎小管擴(kuò)張，細(xì)胞腫脹，髓質(zhì)充血，呈中度至重度壞死，以上指標(biāo)證明了模型的成功.BA-L治療后各指標(biāo)水平顯著降低，表明BA-L能改善AKI大鼠腎功能.腎缺血再灌注損傷時(shí)功能障礙致細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抗自由基能力受損.MDA是自由基引起的脂質(zhì)過氧化過程中生成的一種醛類物質(zhì)，其含量在一定程度上反應(yīng)機(jī)體內(nèi)氧自由基代謝和脂質(zhì)過氧化損傷程度，是評(píng)價(jià)氧化損傷的重要指標(biāo).SOD可清除體內(nèi)氧自由基，發(fā)揮抗氧化作用從而保護(hù)細(xì)胞.研究結(jié)果表明：BA-L能減少AKI大鼠腎組織MDA含量，提高SOD活性，該作用呈一定的劑量依賴性.腎組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)，模型大鼠腎小管擴(kuò)張，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞空泡化，髓質(zhì)充血，呈中度至重度壞死；BA-L治療后大鼠腎組織只有輕微改變(腎小球和腎小管上皮細(xì)胞輕度水腫)與生化檢查結(jié)果一致.這些數(shù)據(jù)證明，BA-L有良好的治療AKI作用.

4 結(jié) 論

研究首次發(fā)現(xiàn)50，100，200 μg/kg三個(gè)劑量的BA-L治療大鼠缺血再灌注24 h造成的AKI后，能改善AKI大鼠腎功能，減輕氧化損傷，腎組織損傷明顯減輕，證明BA-L有良好的抗AKI之效.且100 μg/kg時(shí)BA-L效果最佳，加大劑量藥效反而減弱.實(shí)驗(yàn)給藥時(shí)間定為大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉45 min后，屬于治療用藥，所得結(jié)果比預(yù)防用藥更符合臨床治療實(shí)際.BA-L有望開發(fā)成為臨床AKI治療藥物，對(duì)于尚無有效藥物治療的AKI患者是一種福音，這為AKI的治療提供了新線索，新思路.

參考文獻(xiàn)：

[1] AREEF I, JAY L X, JONATHAN H, et al. Acute kidney injury increase risk of esrd among elderly[J]. Journal of the American Society of Nephrology,2009,20(1):223-228.

[2] LAFRANCE J P, DONALD R M. Acute kidney injury associates with increased long-term mortality[J]. Journal of the American Society of Nephrology,2010,21(2):345-352.

[3] SHARFUDDIN A A, MOLITORIS B A. Pathophysiology of ischemic acute kidney injury[J]. Nature Review Nephrology,2011,7:189-200.

[4] BONVENTRE J V, LI YANG. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury[J]. Journal of Clinical Investigation,2011,121(11):4210-4221.

[5] GRAMS M E, RABB H.The distant organ effects of acute kidney injury[J]. Kidney International,2012,81:942-948.

[6] SCHRIER R W, ARNOLD P E,Putten V J, et al. Cellular calcium in ischemic acute renal failure: role of calcium entry blockers[J]. Kidney International,1987,32:313-321.

[7] KHOURY W, NAMNESNIKOV M,FEDOROV D, et al.Mannitol attenuates kidney damage induced by xanthine oxidase-associated pancreas ischemia-reperfusion[J]. Journal of Surgical Research,2010,160(1):163-168.

[8] SCHRIER R W. Role of calcium channel blockers in protection against experimental renal injury[J]. The American Journal of Medicine,1991,90(5):21-26.

[9] 宋必衛(wèi),儲(chǔ)紹興.BAPTA-AM的研究現(xiàn)狀[J].中國藥理學(xué)報(bào),2009,25(7):851-853.

[10] 施水娟,宋必衛(wèi).BAPTA-AM對(duì)MDCK細(xì)胞的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2012,28(2):255-260.

[11] 宋必衛(wèi),駱錢芬.BAPTA-AM對(duì)OGD-再灌致HepG-2細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,41(2):133-137.

[12] 楊毅,宋必衛(wèi).BAPTA-AM脂質(zhì)體抗D-GalN/LPS所致的小鼠急性肝衰竭[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,41(3):280-285.

[13] 蔡燕,付再林,顧喜燕,等.BAPTA-AM抗D-GalN致L-02細(xì)胞損傷作用[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,38(3):326-331.

[14] HEYMAN S N, ROSENBERGER C, ROSEN S. Experimental ischemia-reperfusion: biases and myths-the proximal vs. Distal hypoxic tubular injury debate revisited[J]. Kidney International,2010,77(1):9-16.

[15] LANGE C, TOGEL F, CLAYTON F, et al. Administered mesenchymal stem cells enhance recovery from ischemia/reperfusion-induced acute renal failure in rats[J]. Kidney International,2005,68:1613-1617.

[16] PALLER M S, HOIDAL J R, FERRIS T F. Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat[J]. Journal of Clinical Investigation,1984,74(4):1156-1164.

[17] BRIGUORI C, VISCOI G, RIVERA N V, et al. Cystatin C and contrast-induced acute kidney injury[J]. Circulation,2010,121:2117-2122.

[18] YU Q, ALDERLIESTENET M C,STOKMAN G, et al. Focal adhesion kinase signaling mediates acute renal injury induced by ischemia/reperfusion[J]. The American Journal of Pathology,2011,179(6):2766-2778.