黑木耳多糖的抑菌活性與單糖組分分析

，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 杭州 310014)

黑木耳又稱木耳，為擔(dān)子菌綱目耳科代表種，是一種藥食兼用真菌.世界上90%以上的黑木耳產(chǎn)自于我國，具有巨大的開發(fā)潛力[1].黑木耳多糖具有豐富的生物活性，能夠預(yù)防冠心病、高血脂、高血壓等疾病，并具有抗衰老、抗血栓、抗癌防癌、調(diào)節(jié)免疫等功效[2].研究發(fā)現(xiàn)黑木耳多糖的組分與其生理功能密切相關(guān)[3].因此，深入研究黑木耳多糖，開發(fā)其功能性食品、保健品和藥品是黑木耳資源利用的發(fā)展方向之一.

黑木耳多糖的提取多采用傳統(tǒng)熱水浸提法，但該方法耗時(shí)長、產(chǎn)量低，需要進(jìn)一步優(yōu)化.目前，對于黑木耳多糖活性的研究，大多圍繞其免疫調(diào)節(jié)等展開.據(jù)少量研究報(bào)道，黑木耳多糖具有抑菌活性.樊黎生等[4]研究了黑木耳多糖的抗菌效果，得出黑木耳多糖AAP-Ⅱa級分對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑菌作用.李公斌等[5]研究了硫酸酯化黑木耳多糖的抑菌功能，得出硫酸酯化黑木耳多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑曲霉有不同程度的抑制.但是，對于黑木耳多糖的抑菌活性的研究仍處于探索階段.研究發(fā)現(xiàn)，多糖活性與其單糖組分有關(guān)[6-7].陳瓊?cè)A等[8]利用紙層析和氣相色譜技術(shù)分析黑木耳多糖的組成，確定該多糖主要由L-巖藻糖、D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖等單糖組成.Morisaki等[9]采用酸水解、乙?；燃夹g(shù)處理，對黑木耳中兩種酸性雜多糖的單糖組成進(jìn)行分析，得到D-木糖、D-葡萄糖醛酸和D-甘露糖是兩種多糖的主要單糖成分.黑木耳多糖的單糖組成與其生物活性和構(gòu)效關(guān)系密切相關(guān)，因此，深入分析黑木耳多糖的結(jié)構(gòu)組成有利于該多糖生物活性的研究，進(jìn)一步推動(dòng)黑木耳產(chǎn)品的開發(fā).

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

黑木耳產(chǎn)自浙江金華，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃色微球菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌，黑曲霉、啤酒酵母等真菌由浙江工業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

L-巖藻糖、D-木糖、D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、L-鼠李糖，硼氫化鈉，二甲基亞砜，三氟乙酸，碘甲烷等試驗(yàn)試劑購買于美國Sigma公司.填料DEAE-Sepharose Fast Flow和SephacrylS400購于美國GE公司.氯仿、甲醇、乙醇、乙酸、醋酐、甲苯、無水硫酸鈉等均為分析純.

恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器公司)；三頻恒溫?cái)?shù)控超聲清洗儀KQ-300 GVDV(昆山超聲儀器有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器SENCO(申生科技有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(日本Hitachi公司)；Agilent氣相色譜7890A(美國Agilent公司)；752型紫外-可見分光光度計(jì)(上海光學(xué)儀器有限公司)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(美國Agilent公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳粗多糖的提取

取黑木耳子實(shí)體烘干(60 ℃，6 h)至恒重后粉碎.稱取子實(shí)體干粉10 g，用95%乙醇脫脂24 h后熱水浸提，趁熱過濾.濾液經(jīng)10 000 r/min離心10 min.取上清液，用Sevag法脫蛋白后，加入無水乙醇至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，搖勻后放置24 h，10 000 r/min離心10 min，取沉淀，冷凍干燥得粗多糖AAP80.

1.2.2 黑木耳粗多糖的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用硫酸-苯酚法測定多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù).精確稱取無水葡萄糖0.5 g，稀釋至100 mL，再取該溶液1 mL溶于50 mL容量瓶并定容.分別取0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL各補(bǔ)水至2 mL.分別依次加6%苯酚1 mL和5 mL濃硫酸，震蕩后置于沸水浴中加熱15 min.取出各試管放在冰水中迅速冷卻，用紫外分光光度計(jì)在490 nm處測定其吸光值.得到回歸方程y=0.705 6x+0.054 5，R2=0.999 3.

粗多糖得率測定式為

多糖得率=多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)/原料質(zhì)量×100%

1.2.3 黑木耳粗多糖抑菌活性

1) 抑菌圈法測定抑菌效果

于超凈工作臺，分別將已活化各菌種接種到已滅菌的培養(yǎng)基三角燒瓶中，細(xì)菌37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，真菌28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后置冰箱中保存，供試菌分別稀釋成10-7～l0-8cfu/mL備用[7].

抑菌效果的檢測采用牛津杯法[10].牛津杯放入干燥培養(yǎng)皿，121 ℃高壓蒸汽滅菌30 min.趁熱將滅菌后固體培養(yǎng)基倒入平皿，冷卻凝固后在表面加入混有1 mL菌液的半固體培養(yǎng)基，然后將各平皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中.每個(gè)平皿中放入2個(gè)牛津杯，一個(gè)注射200 μL的多糖溶液，另外一個(gè)加入無菌水作為對照.每種菌3次重復(fù)，測量抑菌圈的平均值.

2) 最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)

用兩倍稀釋法[11-12]將黑木耳多糖溶液稀釋成3.125，6.25，12.5，25，50和100 mg/mL，向牛津杯中加入各濃度多糖溶液200 μL，放入恒溫培養(yǎng)箱中在適宜溫度下培養(yǎng)，觀察各個(gè)質(zhì)量濃度每種菌液抑菌情況并測定對各種菌液最小抑制質(zhì)量濃度.

1.2.4 粗多糖AAP80純化

取粗多糖AAP80溶于蒸餾水中，配制成1 mg/mL的溶液，10 000 r/min離心10 min.取上清液過孔徑為0.45 μm微孔濾膜，濾液先過DEAE-Sepharose Fast Flow預(yù)裝柱進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定梯度洗脫時(shí)間，鹽濃度的選擇.確定上樣量為20 mL，以蒸餾水洗脫，再用0.1，0.2，0.4，2 mol/L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，自動(dòng)部分收集儀分步收集流分，洗脫液每10 mL收集一管.采用苯酚-硫酸法檢測，以吸光值為縱坐標(biāo)，洗脫管號為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，將0.2 mol/L NaCl洗脫液濃縮、脫鹽、冷凍干燥得AAP80-3.

采用Sephacryl S-400凝膠層析柱對樣品進(jìn)行純化.稱量離子層析后凍干樣品適量，溶于蒸餾水中配成5 mg/mL的多糖溶液，高速離心后過孔徑為0.45 μm的微孔濾膜.取濾過液上S-400的凝膠層析系統(tǒng)，洗脫液采用流速為1 mL/min的蒸餾水，上樣體積為1 mL，采用分部收集器收集流分，以吸光度對洗脫體積作圖.

1.2.5 單糖組成的測定

1) 標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品的乙酰化

精密稱量等摩爾的L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖和D-葡萄糖，分別溶解在3 mL蒸餾水中成2 mmol/L溶液.加20～30 mg硼氫化鈉(NaBH4)，置于25 ℃條件下，間歇振蕩3 h.用冰乙酸中和過量的NaBH4至溶液不再產(chǎn)生氣泡為止，再加入3 mL甲醇，減壓濃縮蒸干，重復(fù)操作4到5次.濃縮樣品在烘箱中110 ℃下加熱15 min，除去多余水分.干燥樣品加4 mL醋酐，100 ℃條件下反應(yīng)1 h，冷卻后加3 mL甲苯，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，重復(fù)4到5次.將乙酰化后得到的產(chǎn)物溶解于3 mL氯仿，加適量蒸餾水充分震蕩，除去水溶液，重復(fù)4到5次.氯仿層用適量的無水硫酸鈉干燥，定容至10 mL待測[6].

2) 樣品乙酰化的處理

稱量多糖樣品2 mg，置于梨型瓶中，平行處理三個(gè)樣，分別加4 mL濃度為2 mol/L的三氟乙酸(TFA)，110 ℃下水解2 h.將水解液在40 ℃以下減壓旋干，加3～4 mL甲醇混勻后減壓蒸干，重復(fù)4到5次.按照標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品乙?；椒ㄟM(jìn)行還原、乙?；寐确露ㄈ葜? mL，待測[13-14].

3) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

HP-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，F(xiàn)ID檢測器，高純氮作載氣，柱流速1 mL/min.升溫程序：柱初溫120 ℃，以10 ℃/min升至240 ℃，保持6.5 min.進(jìn)樣量為1 μL，分流比1∶30，氫氣35 mL/min，空氣350 mL/min，尾吹氣30 mL/min.接口溫度和離子源溫度均為250 ℃.質(zhì)量數(shù)掃描時(shí)間

為0.28 s，掃描范圍是40～500 amu[15].

2 結(jié)果與討論

2.1 黑木耳多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 液料比對黑木耳多糖提取的影響

稱10 g黑木耳干粉末，選取不同液料比，設(shè)定浸提溫度100 ℃，提取時(shí)間3 h,4次，得到的黑木耳粗多糖得率如圖1(a)所示.從圖1(a)中可以看出：當(dāng)液料比低于60時(shí)，隨著液料比的增加多糖得率增加，而當(dāng)液料比為60多糖的得率(5.47±0.07)%后，多糖得率增加緩慢.

2.1.2 溫度對黑木耳多糖提取的影響

稱10 g黑木耳干粉末，選取不同提取時(shí)間，設(shè)定液料比60∶1，浸提時(shí)間3 h，次數(shù)4次，得到的黑木耳粗多糖得率如圖1(b)所示.該圖顯示，黑木耳多糖的得率隨溫度升高而逐步逐提高，因此選擇浸提溫度100 ℃最佳.

2.1.3 時(shí)間對黑木耳多糖提取的影響

稱10 g黑木耳干粉末，選取不同提取時(shí)間，設(shè)定液料比60∶1，浸提溫度100 ℃，次數(shù)4次，得到的黑木耳粗多糖得率如圖1(c)所示.由圖1(c)中可以看出：1～4 h多糖得率隨著提取時(shí)間的增加逐漸增加，多糖得率在4 h最高(5.36±0.14)%，之后曲線變化不大.

2.1.4 提取次數(shù)對黑木耳多糖提取的影響

稱10 g黑木耳干粉末，設(shè)定浸提溫度100 ℃，液料比60∶1，時(shí)間4 h時(shí)，不同的提取次數(shù)得到的黑木耳粗多糖得率如圖1(d)所示.隨著提取次數(shù)的增加，黑木耳多糖的得率也有相應(yīng)提高，但是3次提取后多糖得率為(5.41±0.11)%，以后增幅不明顯.

2.2 黑木耳提取工藝優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)，料液比、浸提時(shí)間、提取次數(shù)、浸提溫度對多糖的得率均有影響.因此，本研究通過L9(3)4正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)獲得黑木耳多糖的最佳提取工藝.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1，2.

表1 單因素試驗(yàn)的因素-水平

圖1 不同因素對黑木耳粗多糖得率的影響

表2 黑木耳多糖正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)表

通過正交實(shí)驗(yàn)方差分析得出，影響黑木耳多糖得率的各因素大小順序A>B>D>C，最佳提取工藝組合A3B3C2D3，即:料液比1∶70，提取時(shí)間4 h，溫度90 ℃，提取次數(shù)4次，得率6.89%.

2.3 黑木耳粗多糖抑菌實(shí)驗(yàn)

2.3.1 黑木耳粗多糖抑菌效果

從圖2中可以看出：大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在黑木耳粗多糖的作用下有明顯的抑制，且對大腸桿菌的抑制效果小于金黃色葡萄球菌，抑菌圈分別為(5.55±0.182)mm和(9.84±0.076) mm.對枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌和兩種真菌沒有抑菌活性.

1—金黃色葡萄球菌；2—大腸桿菌；3—枯草芽孢桿菌；4—藤黃微球菌；5—啤酒酵母；6—黑曲霉；7—無菌水

2.3.2 最小抑制質(zhì)量濃度的測定(MIC)

從圖3中可以看出：隨著質(zhì)量濃度的減小，粗多糖的抑菌活性減弱.黑木耳多糖質(zhì)量濃度低于12.5 mg/mL對大腸桿菌沒抑制作用.質(zhì)量濃度低于6.25 mg/mL對金黃色葡萄球菌無抑制作用.因此，黑木耳粗多糖對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌最低抑制質(zhì)量濃度分別為6.25和12.5 mg/mL.

圖3 黑木耳粗多糖最小抑菌質(zhì)量濃度

2.4 黑木耳粗多糖離子交換柱層析純化

黑木耳粗多糖AAP80經(jīng)過DEAE-Sepharose Fast Flow分離后，得到了4個(gè)組分，分別為AAP80-1，AAP80-2，AAP80-3和AAP80-4，如圖4所示.AAP80-1為純水洗脫下來的多糖部分，其他3個(gè)組分分別為0.1，0.2，0.4 mol/L的NaCl溶液洗脫下來的部分.其中AAP80-3峰面積較大，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，收集此部分洗脫液.通過Sephadex G25凝膠柱脫鹽，用示差檢測器跟蹤收集脫鹽后組分，濃縮后冷凍干燥.

圖4 黑木耳多糖洗脫曲線

2.5 AAP80-3凝膠柱層析純化

得到粗多糖AAP80-3的分子量分布和結(jié)構(gòu)并不一致，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步純化.如圖5所示為AAP80-3經(jīng)SephacrylS-400凝膠柱層析得到的洗脫曲線，收集17—25管洗脫液，濃縮凍干后命名為AAP80-3a.如圖6所示0～20 min內(nèi)AAP80-3a在HPLC的凝膠層析中為單一對稱峰，證明其為均一組.

圖5 AAP80-3的Sephacryl S400層析洗脫曲線

圖6 AAP80-3a的HPLC曲線

2.6 AAP80-3a單糖組成

圖7為氣相色譜混標(biāo)總離子流圖，表3為混標(biāo)中各單糖的保留時(shí)間和各組分的平均面積百分含量，RSD1為混合重復(fù)進(jìn)樣6次的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，RSD2平行處理6組混標(biāo)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值，算出RSD1與RSD2都小于5%，說明所用乙?；椒刹僮餍暂^好.由平均面積百分含量推算出各單糖組分相對于儀器的響應(yīng)因子，以備后續(xù)樣品組分摩爾比的計(jì)算.

由單糖標(biāo)品乙?；苌餁赓|(zhì)色譜圖的出峰時(shí)間，可以判斷混標(biāo)氣相色譜圖的出峰順序?yàn)長-鼠李糖、L-阿拉伯糖、L-巖藻糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖.

表3 混合標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜結(jié)果及分析

經(jīng)GC-MS測定圖8，比對圖7可以看出:AAP80-3a中主要含有一種多糖，另含的兩種單糖量很少，對照單糖混標(biāo)的出峰時(shí)間表3，可以看出其主要含有D-葡萄糖，另外還含有少量的D-甘露糖和D-半乳糖，其摩爾比為1∶0.26∶0.15.

1—鼠李糖(10.652 min)；2—阿拉伯糖(10.749 min)；3—巖藻糖(10.781 min)；4—木糖(10.958 min)；5—甘露糖(13.018 min)；6—葡萄糖(13.103 min)；7—半乳糖(13.173 min)

圖8 AAP80-3a的乙酰化衍生物總離子流圖

3 結(jié) 論

本研究采用傳統(tǒng)的水提醇沉提取工藝，得到了提取溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h，提取次數(shù)4次，料液比1∶70的黑木耳多糖最佳提取工藝.黑木耳多糖得率為6.89%，多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為71.62%.黑木耳粗多糖對大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，且對金黃色葡萄球菌的抑制作用大于大腸桿菌，而對于枯草芽孢桿菌和藤黃微球菌沒有抑制作用.對真菌啤酒酵母菌和黑曲霉也沒有抑制生長作用.實(shí)驗(yàn)中得出了黑木耳粗多糖最低抑菌濃度低，但是黑木耳粗多糖的抗菌機(jī)理有待進(jìn)一步研究.從黑木耳子實(shí)體提取的多糖AAP80經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析后得到組分AAP80-3，AAP80-3經(jīng)SephacrylS-400凝膠柱層析純化得到單一多糖組分AAP80-3a.AAP80-3a主要含有D-葡萄糖、D-甘露糖和D-半乳糖，其摩爾比為1∶0.26∶0.15.

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