不同運動強度對青春期肥胖大鼠脂聯(lián)素的影響

柏友萍， 李 萌， 崔建飛， 許曉東， 戴園園， 張 晶， 聶劉旺

(1.安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

不同運動強度對青春期肥胖大鼠脂聯(lián)素的影響

柏友萍1， 李 萌1， 崔建飛1， 許曉東1， 戴園園1， 張 晶1， 聶劉旺2

(1.安徽師范大學(xué) 體育學(xué)院，安徽 蕪湖 241003；2.安徽師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，安徽 蕪湖 241000)

目的：探討不同運動強度對青春期肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達、蛋白表達及血漿濃度的影響.方法：選取青春期SD大鼠普食8只為單純空白對照組(C)，高脂誘導(dǎo)青春期肥胖32只隨機分為4組，每組8只，分為靜止對照組(OC)、低運動強度組(OL)、中運動強度組(OM)和高運動強度組(OH).運動速度為15-18m/min、21-25m/min和28-32m/min，坡度均為0，1h/天，5次/周，在大鼠專用運動跑臺持續(xù)8周的運動干預(yù).8周后用qRT-PCR測內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達，免疫組化測內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達，ELISA測血漿脂聯(lián)素濃度.結(jié)果：8周后OL、OM、OH組體重、內(nèi)臟脂肪重量及體脂率均顯著低于OC組(P<0.01)，OM、OH組內(nèi)臟脂肪重量及體脂率顯著低于OL組(P<0.01)；OM、OH組內(nèi)臟脂肪脂聯(lián)素mRNA高于OC、OL組(P<0.05，P<0.01)；OH組脂聯(lián)素蛋白質(zhì)的表達均比OC組增加；OL、OM、OH組血漿脂聯(lián)素濃度較OC組顯著提高(P<0.01)，OM、OH組顯著高于OL組(P<0.05，P<0.01).結(jié)論：通過8周不同運動強度干預(yù)均顯著降低了青春期肥胖大鼠體重、內(nèi)臟脂肪量和體脂率，上調(diào)了內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素 mRNA的基因表達及蛋白表達，升高血漿脂聯(lián)素濃度，均為中、高運動強度效果較明顯.

運動強度；青春期肥胖；脂肪組織；體脂率；脂聯(lián)素

目前全世界有超過 15 億的超重和肥胖人群，預(yù)計到 2030 年超重和肥胖人群將增加到21.6億和11.2億[1].2010年國民體質(zhì)監(jiān)測結(jié)果顯示，青春期超重和肥胖人群在驚人的增長[2].脂肪細胞的數(shù)目增加或體積的增大是肥胖主要特征之一，在青春期二者兼有.青春期肥胖可能引起成人期的健康負擔，已被視為亟待解決的一個公共衛(wèi)生問題.運動有助于減肥已為人們所熟知，如何進行科學(xué)運動減肥引起學(xué)術(shù)界的研究興趣.在健身中采用運動處方進行體育鍛煉是比較科學(xué)的，運動強度制訂是否恰當直接影響運動處方實施的效果，在運動減肥中運動強度同樣關(guān)鍵，適宜運動強度制定是決定運動減肥效果的最重要核心要素之一[3].

脂聯(lián)素(adiponectin，ADP)是Yamanchi[4]等領(lǐng)導(dǎo)的研究小組發(fā)現(xiàn)的一種脂肪細胞分泌的激素蛋白，在脂肪組織中大量表達，主要由脂肪細胞分泌，具有多種生物學(xué)功能.脂聯(lián)素是脂肪組織特異性分泌，在肥胖形成過程中，脂聯(lián)素分泌發(fā)生異常，對機體的胰島素抵抗和糖脂代謝起著重要作用[4].目前，脂聯(lián)素的分泌調(diào)控與肥胖的關(guān)系一直是國內(nèi)外的研究熱點.能否通過不同運動強度干預(yù)來調(diào)節(jié)脂聯(lián)素在內(nèi)臟脂肪組織中的基因表達、蛋白表達和血液中的濃度以達到防控肥胖預(yù)防相關(guān)疾病的目的？弄清這個問題對于明晰運動減肥的作用機制無疑具有重要的理論價值.本研究擬采用高脂飲食飼喂SD大鼠7周，誘導(dǎo)建立青春期單純肥胖模型，分別設(shè)置高、中和低運動強度進行運動干預(yù).8周后，采用qRT-PCR、免疫組化及酶聯(lián)免疫等技術(shù)，研究不同運動強度對青春期肥胖大鼠的體重、內(nèi)臟脂肪重量及體脂率等減肥相關(guān)指標的影響，對青春期肥胖大鼠的內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素的mRNA基因表達和蛋白表達及血漿濃度的影響.

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組

3周齡的離乳雄性SD幼鼠，清潔級，體重75.52±7.64 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK (滬)2012-0002.隨機分為普食組和高脂組，體重?zé)o差異(P>0.05).普食組喂普通飼料，高脂組喂高脂飼料，7周建模成功(成功標準：肥胖組體重>20%對照組體重[5])，對照組體重為378.92±24.70(g)，根據(jù)上述標準肥胖傾向大鼠體重應(yīng)為454.70(g)，本實驗建模成功大鼠體重為469.82±19.25(g).選取自然生長8只青春期SD大鼠為單純空白對照組(C)；選取32只肥胖大鼠，隨機分為4組：肥胖對照組(OC)，運動組分為低運動強度組(OL)、中運動強度組(OM)和高運動強度組(OH)，每組8只(見表1).實驗期間，大鼠分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)房的溫度為20℃±2℃，相對濕度50%-70%，每天光照為12h，每周測量一次體重和體長.

表1 實驗大鼠分組的一般情況(M±SD)

注：one-way ANOVA分析，P>0.05(C組除外)

1.2運動方案設(shè)計與實施

運動方案設(shè)計為低、中、高三種運動強度，干預(yù)8周.開始進行2-3次/天的適應(yīng)性跑臺練習(xí)，訓(xùn)練3天.C組和OC組不施加運動負荷，安靜狀態(tài)下籠養(yǎng).實驗組的運動方式以動物運動模型Bedford方案[6]為依據(jù)進行改進，OL、OM和OH組跑臺速度分別為15-18m/min、21-25 m/min和28-32 m/min，跑臺坡度為0，60min/天， 5次/周，周一、周四休息，干預(yù)期間喂普通飼料，每天進食量控制一致，自由飲水，每周末運動干預(yù)結(jié)束后測量體重、體長.

1.3主要實驗儀器與試劑

儀器：電子秤(JM-A20001/中國)，電子分析天平(BS223S/北京)，6跑道大鼠跑臺(北京).全自動生化分析儀(日立7060)，酶標儀(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板機(Tecan Columbus Washer/瑞士)，冰凍切片機(LEICACM1900型/德國)，萬能熒光顯微鏡BX61高分辨成像系統(tǒng)(DP71/日本)，實時熒光定量PCR儀(博日line-gene K FQD-48A)，超低溫高速離心機(Eppendorf Centrifuge 5417).

試劑：免疫組化抗體試劑盒(北京博奧森)，脂聯(lián)素的ELISA 試劑盒(美國R&D公司)，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega M1705)，SunShineBioTM總RNA提取試劑(SunShineBio SN114).

1.4ELISA測定血漿脂聯(lián)素

8周干預(yù)后，對實驗大鼠禁食12h，禁水6h.每組隨機取6只，用水合氯醛溶液(8%)腹腔注射麻醉，麻醉后測量體重，剖腹取腹主動脈血，分離血漿，保存在-80℃冰箱待ELISA測定.脂聯(lián)素采用ELISA中的雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗測定，ELISA操作方法嚴格按照試劑盒使用說明書提供的程序進行，脂聯(lián)素濃度值：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，脂聯(lián)素回歸曲線方程為y=0.026x-0.001，標準品試劑測量值與實際測量值相關(guān)系數(shù)r=0.999，把該方程代入Excel工作表中，得到相應(yīng)的濃度值，此濃度值再乘以5為樣本實際濃度.

1.5免疫組化測定內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達

每組中剩下2只麻醉后剖胸，從左心室灌注4%的甲醛溶液，從右心耳流出，固定大鼠，取內(nèi)臟脂肪組織稱重.取部分內(nèi)臟脂肪組織固定于4%的甲醛和蔗糖混合溶液中，待免疫組化測定.選取少許內(nèi)臟脂肪組織，加膠包埋放入-20℃冰凍切片機內(nèi)，連續(xù)冰凍切片40μm，按順序放入多孔板的PBS溶液中，然后撈至玻璃片上.用過氧化氫與純甲醇混合浸泡→緩沖液沖洗→0.3%Triton-x 100-PBS中浸泡→滴加小牛血清，室溫孵育20min；擦干滴加一抗(脂聯(lián)素)工作液4℃孵育36h，在常溫下孵育2h后用PBS緩沖液洗→擦干滴加二抗室溫孵育2h，PBS緩沖液洗→擦干滴加三抗室溫孵育2h，PBS緩沖液洗→擦干轉(zhuǎn)入顯色液中.依次滴加A、B、C顯色試劑顯色3-15 min，觀察顯色結(jié)果.蒸餾水充分沖洗→脫水→透明→封片.最后轉(zhuǎn)入顯微鏡下觀察脂聯(lián)素在脂肪組織的顯色及采集圖片.

1.6qRT-PCR測內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA的表達

取內(nèi)臟脂肪組織(附睪及腎周脂肪)，稱脂肪重量，取部分含血管少的脂肪組織立即置于Trizol中，保存在-80℃冰箱，待測脂聯(lián)素 mRNA值.根據(jù)GenBank公布的SD大鼠脂聯(lián)素基因和β-actin基因序列設(shè)計相應(yīng)的引物，委托上海生工技術(shù)有限公司合成.脂聯(lián)素rat-gAd-F：GGGACAACAATGGACTCTATG，rat-gAd-R：CTGTCGCCTGTTCTTTGATTC；β-actin Beta-Actin-F：GGGAAATCGTGCGTGACATT，Beta-Actin-R：GCGGCAGTGGCCATCTC.總RNA的提取→RT反應(yīng)→SYBR Green Realtime-PCR.循環(huán)條件為 95℃變性55s，48℃退火(β-actin退火溫度是 58℃)40s，79.5℃延伸45s，共40個循環(huán).脂聯(lián)素熔解曲線 Tm 79.5℃(見圖1).按照上述實驗方法得出數(shù)據(jù)，閾值與Ct值由軟件自動得出.目的基因的相對表達量采用2-△Ct法來進行相對定量，其中△Ct=Ct目的基因-Ctβ-Actin).

圖1 gAdiponect mRNA expression in visceral fat rats

1.7統(tǒng)計方法

對實驗前后的一系列指標的數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計軟件包SPSS17.0進行數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(M±SD)表示，多組間差異比較采用one-way ANOVA檢驗，P>0.05無顯著性差異，P<0.05有顯著性差異，P<0.01有非常顯著性差異.

2 結(jié)果

2.1不同運動強度實驗后體重、內(nèi)臟脂肪量和體脂率的比較

由表2、圖2和圖3可知，該體重為禁食禁水麻醉后測量的大鼠體重，為更精確體脂率所用，取內(nèi)臟脂肪組織用無菌吸水紙吸干后稱重，體脂率=內(nèi)臟脂肪重量/麻醉后體重×100%.①體重比較：OC組高于C組(P<0.05)，OH組低于C組(P<0.01)；OL、OM、OH組顯著低于OC組(P<0.01)，OL組高于OH組(P<0.05)，OL高于OM組、OM高于OH組，但無差異(P>0.05).②內(nèi)臟脂肪量和體脂率的比較：OL、OM、OH組顯著低于C、OC組(P<0.01)，OL組顯著高于OM、OH組(P<0.05，P<0.01)，C組與OC組、OM組與OH組之間無差異(P>0.05).該結(jié)果表明：運動能明顯降低麻醉后體重，伴隨運動強度增加而降低明顯，中、高強度運動明顯低于低強度運動；不同運動強度顯著降低內(nèi)臟脂肪量和體脂率，隨著運動強度增加而下降明顯，中、高強度運動明顯低于低強度運動.麻醉后體重、內(nèi)臟脂肪量和體脂率運動組均低于自然生長組.

表2 不同運動強度實驗后大鼠體重、內(nèi)臟脂肪量及體脂率比較(M±SD，n=8)

注：one-way ANOVA，與C比較：*表示(P<0.05)，**表示(P<0.01)，與OC比較：★表示(P<0.05)★★表示(P<0.01)；與OL組比較：&表示(P<0.05)，&&表示(P<0.01).

圖2 不同運動強度實驗后體重比較

圖3 不同運動強度實驗后內(nèi)臟脂肪量和體脂率比較

2.2不同運動強度實驗后內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達的比較

從表3可知，OM、OH組高于C、OC組(P<0.01)，OM、OH組高于OL組(P<0.05，P<0.01)，C、OC、OL組之間無顯著性差異(P>0.05).肥胖的大鼠脂聯(lián)素高于自然生長，運動能明顯上調(diào)其mRNA表達，伴隨運動強度增加而增大.

2.3不同運動強度實驗后內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素蛋白表達的比較

表3 不同運動強度實驗后大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達比較(M±SD)

注：one-way ANOVA，與C比較：*表示(P<0.05)，**表示(P<0.01)；與OC比較：★表示(P<0.05)，★★表示(P<0.01)；與OL比較：&表示(P<0.05)，&&表示(P<0.01).

圖4 不同強度運動實驗后大鼠內(nèi)臟脂肪脂聯(lián)素蛋白表達的比較

注：圖A為內(nèi)臟脂肪組織常規(guī)尼氏染色圖×200，圖B為不加一抗體免疫組化染色圖，圖C、圖D、圖F、圖H、圖J分別為添加脂聯(lián)素一抗體蛋白表達圖×400.

圖4為青春期大鼠附睪及腎周脂肪組織中脂肪細胞，脂聯(lián)素主要在內(nèi)臟脂肪細胞質(zhì)中表達.在尼氏染色切片上，脂滴被酒精及二甲笨溶解，細胞呈空泡狀，胞核扁圓形，被脂滴推擠到細胞一側(cè)，連同部分胞質(zhì)呈新月形(見圖A)；免疫組化對照圖為未加一抗體(脂聯(lián)素)的蛋白表達圖(圖B)；細胞呈空泡狀，細胞核未顯示，胞質(zhì)呈薄層細線狀，著色較淺；圖C、圖D為空白對照組和肥胖對照組(添加一抗體脂聯(lián)素)脂聯(lián)素蛋白表達免疫組化圖，胞質(zhì)呈薄層粗線狀，著色較圖B加深；圖F、圖H、圖J分別代表低、中、高運動強度實驗組添加一抗體(脂聯(lián)素)蛋白表達免疫組化圖，細胞呈空泡狀，細胞核未顯示，胞質(zhì)呈粗線狀，圖H、圖J顏色較圖F深.從脂肪細胞體積比較顯示：肥胖對照組大鼠的脂肪細胞體積大于其他各組，且隨著運動強度增加，而內(nèi)臟脂肪細胞的體積越小.

2.4不同運動強度實驗后血漿脂聯(lián)素濃度的比較

從表4可知，OL、OM、OH組顯著高于C、OC組(P<0.05，P<0.01)，C、OL、OM、OH組顯著高于OC組(P<0.01)，OM、OH組顯著高于OL組(P<0.05，P<0.01)，C、OC組顯著低于OL組(P<0.05，P<0.01)，OM和OH組之間無顯著性差異(P>0.05).因此，青春期肥胖大鼠的血漿脂聯(lián)素濃度顯著低于自然生長大鼠；運動能提高脂聯(lián)素水平，伴隨運動強度增加而增長.

3 討論

3.1不同運動強度對青春期肥胖大鼠肥胖相關(guān)指標的影響

青少年超重和肥胖的發(fā)生率逐年增高，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)的一個公共健康問題.減肥的方法逐漸增多，如節(jié)食、運動、藥物和外科手術(shù)等[7].研究表明[8-9]，節(jié)食和外科干預(yù)來對抗肥胖，雖然某種程度上取得成功，但對肥胖者身體造成有害影響，對于青春期肥胖學(xué)生來說，最為安全有效的減肥方法是采用運動處方指導(dǎo)的科學(xué)運動減肥，在減肥的同時可以提高健康體適能.體重、體脂百分比已被作為評價健康體適能的重要相關(guān)指標，也是監(jiān)測營養(yǎng)狀況及評價生長發(fā)育指標，在臨床和基礎(chǔ)研究中具有重要應(yīng)用價值[10].

表4 不同運動強度干預(yù)大鼠血漿脂聯(lián)素濃度比較(M±SD，n=6)

注：one-way ANOVA，與C比較：*表示(P<0.05)，**表示(P<0.01)，與OC比較：★表示(P<0.05)，★★表示(P<0.01)，與OL比較：&表示(P<0.05)，&&表示(P<0.01).

有研究認為，中低強度有氧運動可以降低肥胖相關(guān)指標，如體脂百分比、肥胖指數(shù)，長期進行有氧運動能提高機體對脂肪的利用率，加速脂肪的動員速度，增加脂肪功能效率，降低體重和體脂百分比，從而提高運動能力[11-12].本實驗室對青春期肥胖學(xué)生經(jīng)過8周60%-70%F.C.運動強度減肥運動處方實施，其體重、體脂率、BMI均顯著下降，有效改善了青春期肥胖學(xué)生的肥胖程度，取得良好的減肥效果[13-14].Levin BE[15]等研究發(fā)現(xiàn)，膳食誘導(dǎo)的肥胖大鼠經(jīng)過4周跑臺運動后，體重和脂肪含量與安靜組相比都顯著下降.本實驗表明青春期肥胖大鼠體重，伴隨運動強度增加而降低明顯，中、高強度運動體重明顯低于低強度運動；不同運動強度顯著降低內(nèi)臟脂肪量和體脂率，隨著運動強度增加而下降明顯，中、高強度運動明顯低于低強度運動.體重、內(nèi)臟脂肪量和體脂率運動組均低于自然生長組.

3.2不同運動強度對青春期肥胖大鼠脂肪組織脂聯(lián)素的mRNA和蛋白表達影響

脂聯(lián)素是一種具有生物活性膠原樣蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細胞因子，在脂肪細胞分化時僅由白色脂肪組織合成，并在脂肪組織中mRNA大量表達，而脂聯(lián)素受體卻在多種組織中廣泛表達[16-17].有研究證明[18]，肥胖個體的脂聯(lián)素濃度明顯低于非肥胖者，而當體質(zhì)量減輕后，脂聯(lián)素濃度又升高.盡管脂聯(lián)素是有脂肪組織合成，但表現(xiàn)為脂肪組織多而合成減少，脂肪組織重量減少，其濃度依然增加[19].聞穎等[20]在脂肪細胞分化過程中加入姜黃素，3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素mRNA水平增加，經(jīng)姜黃素處理24h的成熟3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素mRNA水平增加.低脂聯(lián)素水平是代謝綜合征的一個獨立危險因素，獨立于肥胖、胰島素抵抗及炎癥標志物，血清脂聯(lián)素水平降低是代謝綜合征的特征性標志[21].

為了探究脂聯(lián)素基因表達和蛋白表達水平是否是肥胖所具有的特征，不同運動強度對其產(chǎn)生怎樣影響？本研究驗證了高脂飲食誘導(dǎo)的青春期肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素mRNA表達及蛋白表達的情況以及不同運動強度對其產(chǎn)生的影響.實驗結(jié)果顯示，肥胖的大鼠脂聯(lián)素mRNA表達高于自然生長，運動能上調(diào)其mRNA表達，伴隨運動強度增加而增大；肥胖大鼠內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素蛋白表達與自然生長的大鼠無明顯差異，運動能增加蛋白表達量，隨著運動強度增加表達量遞增，中、高強度差異明顯；運動能上調(diào)內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素mRNA表達和蛋白表達，二者具有一致性.

4 結(jié)論

通過8周不同運動強度干預(yù)均顯著降低了青春期肥胖大鼠體重、內(nèi)臟脂肪量和體脂率，達到了較好的減肥效果；不同運動強度均上調(diào)了大鼠內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素 mRNA的基因表達及蛋白表達；不同運動強度導(dǎo)致大鼠血漿脂聯(lián)素濃度顯著升高；均為中、高運動強度效果較明顯.

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EffectofAdiponectinonDifferentExerciseIntensityinAdolescentObeseRats

BAI You-ping1， LI Meng1， CUI Jian-fei1， XU Xiao-dong1，DAI Yuan-yuan1， ZHANG Jing1， NIE Liu-wang2

(1.College of Physical Education， Anhui Normal University，Wuhu 241003, China；2.College of Life Sciences, Anhui Normal University, Wuhu 241000, China)

Objective: To explore the effect of adiponectin mRNA expression and protein expression in visceral adipose tissue and plasma concentration on different exercise intensity in adolescent obese rats. Methods: The adolescent SD 8 rats for simple diet control group (C), high fat induced adolescent obesity 32 rats were randomly divided into 4 groups, 8 rats in each group, divided into a control group (OC), low intensity exercise group (OL), medium intensity exercise group (OM)and high intensity exercise group (OH). Exercise groups were practiced with a special motion rat treadmill at the speed of 15-18，21-25，and 28-32m/min，respectively，one hour per day，5 times a week，for 8 weeks．Adiponectin mRNA in adipose tissues was measured with qRT-PCR and protein expression in adipose tissues was measured with the immunohistochemical technique，adiponectin in plasma concentration by ELISA．Results：OL, OM, OH body weight, visceral fat weight and percentage of body fat after 8 weeks were significantly lower than that in OC group (P<0.01), OM, OH group of visceral fat weight and percentage of body fat was lower than that in OL group (P<0.01); Visceral fat adiponectin mRNA of OM, OH group than OC, OL group (P<0.05, P<0.01), OH group of expression of protein of adiponectin increased than OC group; OL, OM, OH group of plasma adiponectin concentrations were significantly increased than OC group (P<0.01), OM, OH group was significantly higher than that in group OL (P<0.05, P<0.01). Conclusion: Through 8 weeks of different intensities of exercise intervention significantly reduced body weight, visceral fat mass and percentage of body fat in adolescent obese rats, the upregulation of adiponectin the expression of the gene expression mRNA and the expression of protein in visceral adipose tissue, increased plasma adiponectin concentrations, the effect of medium and high intensity exercise were obvious.

exercise intensity； adolescent obesity； adipose tissue； body fat percentage； adiponectin

2014-06-23

安徽省高校自然科學(xué)基金重點(KJ2013A138).

柏友萍(1964-)，女，安徽舒城人，教授，在讀博士，研究方向為健身運動處方的生理機理與運動對人體適應(yīng)的分子生物學(xué)機制.

柏友萍，李萌，崔建飛，等.不同運動強度對青春期肥胖大鼠脂聯(lián)素的影響[J].安徽師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，37(4)：394-400.

G804.2

A

1001-2443(2014)04-0394-07