雙酚A降解菌的分離鑒定和降解特性研究

，，

(浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

雙酚A(BPA)是一種重要的化工原料，主要被用來(lái)合成聚碳酸酯(PC)和環(huán)氧樹(shù)脂等材料，在日常生活中得到廣泛運(yùn)用，如嬰兒用的奶瓶，食品包裝，牙科填充劑等[1-2].BPA生產(chǎn)過(guò)程中的泄漏、含BPA的物品不合理處置等途徑都使得BPA很容易進(jìn)入到土壤、水體和大氣中，環(huán)境中BPA污染問(wèn)題廣泛存在[3-4].BPA能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，威脅著胎兒和兒童的健康，癌癥和新陳代謝紊亂導(dǎo)致的肥胖也被認(rèn)為與此有關(guān).此外，BPA是一種重要的內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素活性[5]，BPA在環(huán)境中的暴露對(duì)人類(lèi)健康和其他生物產(chǎn)生了嚴(yán)重的危害[6-7].因此，尋求一種合適的方法減緩或者消除環(huán)境中BPA污染顯得十分重要.相比其他污染修復(fù)方法，微生物修復(fù)技術(shù)具有成本低、二次污染小等優(yōu)點(diǎn)，利用微生物降解BPA的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn).HAYATO YAMANAKA等[8]篩選出三株短小芽胞桿菌屬細(xì)菌，分別命名為BP-2CK，BP-21DK和BP-22DK.這三株菌株在含有營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基里可分別降解質(zhì)量濃度為25，25，50 mg/L的BPA.鄧偉光等[9]分離出一株BPA降解菌，當(dāng)BPA的質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，BPA的去除率達(dá)到最大值44.7%.Ko-ichi Oshiman等[10]分離得到的SphingomonasbisphenolicumAO1可以在48 h內(nèi)降解質(zhì)量濃度100 mg/L的BPA，但是，降解液里須加入1%的葡萄糖.真菌同樣具有對(duì)BPA的降解能力[11-12]：A. Omoike等[11]研究發(fā)現(xiàn)真菌Heliscuslugdunensis在12 d的時(shí)間內(nèi)對(duì)質(zhì)量濃度為10 mg/L的BPA的降解率為70%.本實(shí)驗(yàn)分離篩選得到一個(gè)未被報(bào)道過(guò)的菌屬，該菌株具有高效的BPA降解能力且不需要嚴(yán)格的降解條件，值得對(duì)其進(jìn)行更深一步的研究，所有的研究成果將對(duì)環(huán)境中BPA污染的微生物修復(fù)提供好的基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BPA(純度為99%)，相關(guān)抗生素和甲醇(色譜純)均購(gòu)自阿拉丁，PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(g/L)：NaCl 1，K2HPO41.5，KH2PO40.5，(NH4)2SO41.5，MgSO40.1，溶劑為去離子水，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)后制得.

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基：基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加入1.5%的瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)后制得.

LB 液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉10.0，蛋白胨5.0，氯化鈉10.0，溶劑為去離子水，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)后制得.

LB 固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基加入1.5%的瓊脂粉，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)后制得.

微量元素溶液(g/L)：MnSO4·H2O 0.13，ZnCl20.23，CuSO4·H2O 0.03，CoCl2·6H2O 0.42，Na2MoO4·2H2O 0.15，AlCl3·6H2O 0.05，溶劑為去離子水，自然pH值，高壓蒸汽滅菌(121 ℃，20 min)后制得.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 BPA降解菌的馴化、分離與純化

稱取5 g活性污泥樣品置于100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中(BPA質(zhì)量濃度為20 mg/L)，有氧振蕩培養(yǎng)(30 ℃，150 r/min)1周，取5 mL上層濁液于新鮮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中(BPA質(zhì)量濃度40 mg/L)，繼續(xù)有氧振蕩培養(yǎng)(30 ℃，150 r/min)1周，重復(fù)上述操作過(guò)程6次，每次培養(yǎng)的接種物均取自于上次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液，新的培養(yǎng)基中的BPA質(zhì)量濃度以20 mg/L的梯度遞增.

對(duì)最后一次培養(yǎng)所得的培養(yǎng)液5 mL進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為10-3，10-4，10-5，10-6，取各個(gè)稀釋后的培養(yǎng)液100 μL涂布于含BPA的LB固體培養(yǎng)基(BPA質(zhì)量濃度100 mg/L)上，30 ℃有氧恒溫培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)到合適大小，利用顯微鏡觀察選擇、挑取不同菌落，通過(guò)劃線技術(shù)在LB固體培養(yǎng)基(BPA質(zhì)量濃度100 mg/L)上反復(fù)純化，直至菌落單一.把菌落單一的細(xì)菌分別接種至LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)條件下過(guò)夜培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌液離心(6 000 r/min，5 min)后接至無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中(BPA質(zhì)量濃度為50 mg/L)30 ℃有氧培養(yǎng)3 d，通過(guò)高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)各富集培養(yǎng)液中BPA的殘留量，最后篩選獲得一株能高效降解BPA的菌株Shinellasp. HZB1.

1.2.2 菌種的鑒定

結(jié)合細(xì)菌生理生化、形態(tài)及16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)菌種進(jìn)行鑒定.菌株形態(tài)及生理生化特性測(cè)定參照文獻(xiàn)[14]進(jìn)行.16S rDNA擴(kuò)增引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(正向)，5′-CGGCTACCTTGTTACGACTTC-3′(反向).PCR產(chǎn)物導(dǎo)入大腸桿菌宿主，擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測(cè)序.將測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)16S rDNA序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù).

1.2.3 降解條件優(yōu)化

響應(yīng)面法(Response surface methodology, RSM)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種分析方法，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)幾種因素或者條件進(jìn)行優(yōu)化，找出最佳條件[15].實(shí)驗(yàn)在考察了培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)數(shù)、pH值和初始接種量的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取三個(gè)主要因素進(jìn)行降解條件的優(yōu)化，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取培養(yǎng)溫度、pH值和初始接種量三個(gè)反應(yīng)條件為自變量，以BPA降解率(%)為響應(yīng)值.分析軟件為Design-Expert software(version 8.0.5b)，因素和水平取值見(jiàn)表1.

表1 試驗(yàn)因素水平及編碼

1.2.4 BPA降解實(shí)驗(yàn)

BPA降解、細(xì)菌生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)：將培養(yǎng)24 h的菌液離心，取濕重為0.2 g的菌體接種到100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(BPA質(zhì)量濃度100 mg/L)中，在最適條件下振蕩培養(yǎng)；未接種菌體的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)(BPA質(zhì)量濃度100 mg/L)在最適條件下振蕩培養(yǎng)，作為對(duì)照實(shí)驗(yàn).連續(xù)測(cè)定BPA的降解情況，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)情況.所有的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均重復(fù)三次.

不同BPA初始濃度的降解情況：將培養(yǎng)24 h的菌液離心，取濕重為0.2 g的菌體接種到100 mL(BPA質(zhì)量濃度分別為50，100，150，200，300 mg/L)的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，最適條件下培養(yǎng)，每2 h測(cè)定BPA的降解情況，所有的實(shí)驗(yàn)過(guò)程均重復(fù)三次.

1.3 檢測(cè)方法

BPA降解情況的檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)培養(yǎng)液里BPA的殘留量.降解液在12 000 r/min條件下離心20 min，過(guò)孔徑為0 45 μm的膜，于4 ℃保存?zhèn)溆?HPLC檢測(cè)條件：流動(dòng)相為V(CH3OH)∶V(H2O)=80∶20，分析柱為Grace Alltima C18 Column(4.6 mm×250 mm,5 μm)，檢測(cè)波長(zhǎng)279 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL.

細(xì)菌生長(zhǎng)量的檢測(cè)：用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(JASCO V-550型)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)量.細(xì)菌培養(yǎng)液經(jīng)過(guò)離心(12 000 r/min，20 min，4 ℃)獲得菌體，用等

體積的生理鹽水洗滌3次，然后用等體積的生理鹽水重新懸浮，在600 nm處測(cè)定其OD值.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌種的鑒定

經(jīng)過(guò)一系列馴化、富集篩選過(guò)程，有5株不同的菌株在含BPA無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，分別對(duì)它們的BPA降解能力進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中一株具有明顯的高效降解BPA的能力，選擇這株細(xì)菌保存，用于更進(jìn)一步研究.該菌株為革蘭氏陰性，好氧，有鞭毛，運(yùn)動(dòng)型細(xì)菌，大小(0.5～1.0)×(1.5～2.0) μm(圖1).在LB固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)4 d后，菌落呈淡黃色，濕潤(rùn)，圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，不透明.能利用淀粉、對(duì)硝基苯酚、酵母膏、吐溫40、葡萄糖、作為惟一碳源生長(zhǎng).甲基紅試驗(yàn)陰性，過(guò)氧化氫酶陽(yáng)性，氧化酶陽(yáng)性.該菌抗氨芐青霉素、鏈霉素、氯霉素和卡那霉素，對(duì)慶大霉素敏感.根據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖2所示，通過(guò)序列同源性分析，確定該菌株屬于申氏桿菌屬.

圖1 菌株HZB1的透射電鏡圖

圖2 菌株HZB1的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.2 降解條件優(yōu)化

獨(dú)立變量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值見(jiàn)表2，利用Design Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行多元回歸設(shè)計(jì)及分析，得出二次多項(xiàng)回歸方程為

Y=97.83+2.82X1+2.12X2+0.17X3-

5.23X12-4.08X22-2.28X32

其中：Y為BPA預(yù)測(cè)降解率；X1為溫度；X2為pH；X3為接種量.

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和BPA降解響應(yīng)值

模型的顯著系數(shù)p=0.005 7(p<0.01)，該模型具有高度的顯著性，可靠性極高.溫度和pH對(duì)BPA降解率影響顯著系數(shù)分別為0.003 1，0.010 1，對(duì)降解率的影響顯著，菌體接種量的影響不顯著(p=0.754 1).當(dāng)接種量為0.2 g/L時(shí)，最佳的降解條件為度32.7 ℃，pH 7.5，預(yù)測(cè)降解率達(dá)98.45%.為驗(yàn)證該模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，按照上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得出的實(shí)際降解率為98.10%，與預(yù)測(cè)值十分接近，表示該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際表達(dá)情況.

圖3 HZB1接種量為0.2 g/L的響應(yīng)面圖

2.3 菌株HZB1的生長(zhǎng)和對(duì)BPA的降解曲線

取濕重為0.2 g的菌體接種到100 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(BPA質(zhì)量濃度100 mg/L)中，每?jī)蓚€(gè)小時(shí)測(cè)定菌株的細(xì)胞濃度和BPA的殘留.結(jié)果如圖4所示，經(jīng)過(guò)12 h培養(yǎng)，97.5%的BPA被降解，未加細(xì)菌的空白對(duì)照的BPA質(zhì)量濃度(100 mg/L)基本未變化，這說(shuō)明了菌株HZB1對(duì)BPA具有很強(qiáng)的降解能力.菌細(xì)胞濃度先有所降低，待菌體適應(yīng)了培養(yǎng)基環(huán)境后，細(xì)菌迅速生長(zhǎng)，最大生長(zhǎng)濃度OD600達(dá)到0.23，說(shuō)明該菌株可以以BPA為惟一碳源生長(zhǎng).

圖4 BPA降解和菌株HZB1生長(zhǎng)曲線

2.4 BPA初始濃度對(duì)降解的影響

不同BPA初始濃度對(duì)其降解的影響見(jiàn)圖5.當(dāng)BPA質(zhì)量濃度小于150 mg/L時(shí)，BPA幾乎被完全降解，說(shuō)明該菌株對(duì)低質(zhì)量濃度的BPA具有很好的降解效果.當(dāng)BPA的質(zhì)量濃度達(dá)到200 mg/L時(shí)，77%的BPA被降解，質(zhì)量濃度為300 mg/L時(shí)降解率達(dá)到了42%，該菌株對(duì)BPA耐受質(zhì)量濃度比已報(bào)道的均高，菌株HZB1對(duì)高濃度的BPA污染也有很好的去除作用.

圖5 菌株HZB1對(duì)不同濃度BPA的降解率

3 結(jié) 論

從杭州市某污水處理廠活性污泥中篩選得到了1株BPA高效降解菌.經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性研究和16S rRNA的序列分析，該菌確定為申氏桿菌屬，屬于未曾報(bào)道過(guò)有BPA降解能力的菌屬.菌株對(duì)低質(zhì)量濃度的BPA有很好的降解效果，初始質(zhì)量濃度為100 mg/L的BPA，12 h的降解率達(dá)到97.5%.該菌株對(duì)BPA的最大耐受質(zhì)量濃度達(dá)到300 mg/L.該菌屬對(duì)BPA降解能力和高質(zhì)量濃度的BPA的耐受能力比已有文獻(xiàn)報(bào)道均強(qiáng).此外，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌的降解條件，在細(xì)菌接種量為0.2 g/L時(shí)，溫度32.7 ℃，pH值在7.5為最佳降解條件，最大預(yù)測(cè)降解率為98.45%，這和實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為符合.本實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)為BPA污染微生物修復(fù)提供了理論基礎(chǔ).

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