水溶性N-琥珀酰殼聚糖合成及其共混海藻酸鈉水凝膠特性評價(jià)

，，，，，

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，浙江 杭州 310032；2.浙江泰鴿安全科技有限公司，浙江 杭州 310017)

殼聚糖(chitosan)是甲殼素N-脫乙?；漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性、生物可降解性[1]、抗氧化活性[2-3]及抗癌等作用[4]，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)藥、吸附分離[5-6]等多個(gè)領(lǐng)域，還具有吸附性、成膜性、通透性，以及抗菌、消炎、止血、減少創(chuàng)面液滲出，促進(jìn)創(chuàng)傷組織再生的作用，適合作為敷料使用[7].然而只溶于稀的無機(jī)酸和大多數(shù)有機(jī)酸，不溶于水的特性極大限制了它的應(yīng)用.近年來，通過化學(xué)改性，引入親水性基團(tuán)，研究出了如羧甲基殼聚糖[8]、N-琥珀酰殼聚糖(NSCS)等一系列水溶性殼聚糖.NSCS的化學(xué)修飾使用吡啶和大量丙酮等有毒溶劑[9]，制備的產(chǎn)物對環(huán)境造成影響，應(yīng)用范圍受到一定限制.筆者對常規(guī)修飾方法予以改進(jìn)，避免或減少有毒試劑的使用，降低其毒性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍.

傳統(tǒng)的天然紗布、多聚膜常用敷料，具有吸收能力差，易粘著創(chuàng)面造成機(jī)械性損傷，產(chǎn)生交叉感染等缺陷.Azad等[10]研究了以殼聚糖和海藻酸鹽為代表的新型敷料易形成凝膠，不粘創(chuàng)面，保護(hù)暴露的神經(jīng)末梢；保持創(chuàng)面濕潤，阻隔外界侵入，且可被生物降解，環(huán)保性能好.但在實(shí)際應(yīng)用中，純殼聚糖凝膠敷料自粘性強(qiáng)，但吸水、抗水性差[11]；而海藻酸鹽作為敷料單獨(dú)使用時(shí)有強(qiáng)大而快速吸收滲出液的能力[12]，但黏附性較差.筆者意在將殼聚糖衍生物NSCS與海藻酸鈉(SA)共混，互補(bǔ)兩種凝膠的缺陷從而得到一種性能優(yōu)異的凝膠敷料.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試劑與儀器

殼聚糖購自浙江澳興生物科技有限公司，脫乙酰度90%；海藻酸鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁二酸酐(Succinic anhydride)購自BioBasicCanadaInc.

實(shí)驗(yàn)主要儀器：85-1磁力攪拌器(上海志威儀器有限公司)、FreeZone 6 L真空冷凍干燥器(美國Labconco公司)、Avatar 370傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo Nicolet公司)、DZF-6051型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)和S-4700型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(日本日立公司).

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物

新西蘭兔購自浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK(浙)2009—0039.平均體重為(2.0±0.2) kg，雌雄各半.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 NSCS的合成

在目前的常規(guī)NSCS化學(xué)修飾中，吡啶和大量丙酮等有毒溶劑的使用[9]，對環(huán)境及其應(yīng)用于人體方面都造成了一定影響.筆者對現(xiàn)有NSCS化學(xué)合成進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，在不使用吡啶，及用少量丙酮的前提下，制備得到產(chǎn)物.取殼聚糖0.6 g，溶解于0.2 mol/L的醋酸溶液50 mL中，加入溶有丁二酸酐的丙酮溶液少量，在不同溫度下磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間，反應(yīng)結(jié)束后用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系的pH至5～6，抽濾得到固相，用純凈水進(jìn)行多次洗滌，除去有機(jī)溶劑.將固相置于純凈水中，1 mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至10～12，攪拌至溶解，透析并冷凍干燥得到反應(yīng)產(chǎn)物.修飾反應(yīng)過程為

1.2.2 NSCS/SA水凝膠的制備

取NSCS、SA溶液以不同質(zhì)量比例混合，磁力攪拌3 h至充分共混，對共混水凝膠進(jìn)行抽濾、超聲，去除凝膠內(nèi)不溶物及空氣.70 ℃真空干燥箱下放置12～24 h，得干凝膠，并對其皮膚刺激性進(jìn)行評價(jià).

1.3 分析方法

1.3.1 NSCS水溶性測定及制備工藝優(yōu)化

精確稱取NSCS 0.05 g，加入去離子水5 mL，機(jī)械攪拌3 h至充分溶解，用0.45 μm孔徑微孔濾膜過濾，未通過濾膜的物質(zhì)干重設(shè)為m1(g)，該衍生物的溶解度=(0.05-m1)/5×1 000，單位g/L.以NSCS水溶性為指標(biāo)，研究獲得最佳反應(yīng)條件.

1.3.2 紅外光譜表征

將NSCS產(chǎn)物研碎，和KBr粉末混合壓片，在紅外光譜儀上進(jìn)行測定，找出相關(guān)基團(tuán)的特征吸收峰，與殼聚糖原料進(jìn)行紅外光譜結(jié)構(gòu)分析對比.圖4為NSCS和殼聚糖原料的紅外譜圖.

1.3.3 水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率的測定

將不同比值的凝膠干燥至恒重(Wd)，生理鹽水中浸泡12～24 h，直至達(dá)到溶脹平衡.用濾紙吸去膜樣品表面的水分，稱量溶脹平衡時(shí)水凝膠膜重量，記為Ws(g)，按以下公式計(jì)算凝膠的溶脹率：溶脹率(%)=(Ws-Wd)/Wd×100%.實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值.

按照中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YY/T 0471.2—2004《接觸性創(chuàng)面敷料試驗(yàn)方法第2部分：透氣膜敷料水蒸氣透過率》進(jìn)行水蒸氣透過率(MVTR)的測定.取有效面積為S(cm2)的水凝膠膜封裝于廣口瓶瓶口，進(jìn)行總質(zhì)量稱量，記錄為W1(g).置于(37±1) ℃、濕度為20%的干燥箱，18～24 h后取出，記錄試驗(yàn)時(shí)間T(單位為h，精確到5 min).對容器、樣品和液體重新稱量，記錄質(zhì)量W2(g)，用下式計(jì)算水蒸氣透過率MVTR=(W1-W2)×10 000×24/(T×S).

1.3.4 凝膠截面超微結(jié)構(gòu)觀察

用S-4700型場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)觀察凝膠截面形態(tài)，了解不同的NSCS和SA質(zhì)量比對凝膠結(jié)構(gòu)的影響.將凝膠用液氮脆斷，截面真空噴金后拍照，加速電壓為15 kV.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 底物的質(zhì)量比對NSCS水溶性影響

27.5 ℃，磁力攪拌反應(yīng)3 h條件下，殼聚糖和丁二酸酐不同質(zhì)量比對NSCS水溶性的影響進(jìn)行研究，結(jié)果如圖1所示.

圖1 修飾反應(yīng)時(shí)殼聚糖，底物質(zhì)量比對NSCS水溶性的影響

隨著丁二酸酐質(zhì)量的增加，NSCS的水溶性顯著提升，待殼聚糖/丁二酸酐至1∶2后水溶性逐漸穩(wěn)定；后隨比值的變化水溶性無明顯提升，初步得出底物質(zhì)量比1∶2是最佳比值.

2.1.2 NSCS反應(yīng)時(shí)間對其水溶性影響

底物質(zhì)量比為1∶2，反應(yīng)溫度為27.5 ℃條件下，研究修飾反應(yīng)時(shí)間對NSCS水溶性的影響，結(jié)果如圖2所示.

圖2 反應(yīng)時(shí)間對NSCS水溶性的影響

隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，其水溶性也增強(qiáng)，反應(yīng)至4 h，水溶性達(dá)到最佳，后隨著時(shí)間的增加逐漸變小，說明反應(yīng)4 h就可達(dá)到完全酰化.

2.1.3 反應(yīng)溫度對NSCS水溶性影響

底物質(zhì)量比為1∶2時(shí)，在6個(gè)不同溫度下磁力攪拌?；磻?yīng)4 h條件下，制備NSCS，測定其水溶性，結(jié)果如圖3所示.

圖3 修飾反應(yīng)溫度對NSCS水溶性的影響

由圖3可見：從室溫27.5 ℃開始，隨著溫度的增加，NSCS的水溶性緩慢增加，至50 ℃達(dá)到最佳，60 ℃后隨著溫度的上升，NSCS水溶性顯著降低，說明50 ℃是該?；磻?yīng)的最佳溫度，超過60 ℃，NSCS發(fā)生降解，影響產(chǎn)物水溶性.

2.2 NSCS制備條件正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，確定底物質(zhì)量比、反應(yīng)時(shí)間和溫度的合適范圍，以NSCS水溶性為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化NSCS合成的最佳條件，實(shí)驗(yàn)的極差分析和方差分析見表1，2.

表1 正交實(shí)驗(yàn)極差分析L9(33)

表2 正交實(shí)驗(yàn)方差分析L9(33)

該正交實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)溫度為A；反應(yīng)時(shí)間為B；m(殼聚糖)∶m(丁二酸酐)為C.極差分析和方差分析結(jié)果表明：B和C均不具有顯著性差異，A具有顯著性差異，主次因素關(guān)系為A>C>B，反應(yīng)溫度對產(chǎn)物水溶性影響最大，且反應(yīng)最佳組合為：A2B2C3.因?yàn)镃不具有顯著性差異，實(shí)驗(yàn)中取C2和C3時(shí)的產(chǎn)物水溶性差別不大，考慮底物成本，故底物質(zhì)量比選1∶2，即NSCS制備的最優(yōu)反應(yīng)條件為：反應(yīng)溫度50 ℃，反應(yīng)時(shí)間4 h，底物質(zhì)量比為1∶2.驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，在此條件下產(chǎn)物水溶性為9.70 g/L.

2.3 紅外光譜分析

對修飾制備得到的NSCS和殼聚糖原料做紅外光譜圖，結(jié)果如圖4所示.

圖4 NSCS和殼聚糖原料的紅外譜圖

圖中3 425 cm-1處是殼聚糖分子-OH和-NH2的伸縮振動峰，NSCS相對殼聚糖峰變得窄??；同時(shí)，發(fā)生琥珀?；磻?yīng)后，在3 116 cm-1左右處，NSCS有較明顯的乙酰基吸收峰，而殼聚糖于該處則無吸收峰，都說明殼聚糖分子上的-NH2發(fā)生了?；磻?yīng).在NSCS中，1 651 cm-1處代表酰胺I的吸收峰,1 560 cm-1處代表酰胺II的吸收峰，且在殼聚糖1 600 cm-1處出現(xiàn)的代表-NH2的吸收峰消失，而1 417 cm-1處羧基的對稱振動峰增強(qiáng)，說明產(chǎn)物中出現(xiàn)-NH-CO和羧基，-NH2消失；在1 720～1 750 cm-1處沒有出現(xiàn)代表酯基的吸收峰，說明產(chǎn)物中成功引入琥珀酸酐基團(tuán)，且琥珀?；磻?yīng)發(fā)生在殼聚糖N位上.紅外分析結(jié)果可以證明修飾合成方法能夠準(zhǔn)確制備得到結(jié)構(gòu)完整的NSCS.

2.4 水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率分析

測定不同比值凝膠的溶脹率及其水蒸氣透過率，對其進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5.

圖5 不同質(zhì)量比NSCS和SA對水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率的影響

圖5中，柱狀圖和折線圖分別表示為不同質(zhì)量比NSCS和SA對水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率的影響，由圖5可知:當(dāng)m(NSCS)∶m(SA)=1∶3時(shí)，水凝膠達(dá)到最優(yōu)結(jié)構(gòu)，溶脹率及水蒸氣透過率最佳，分別為557.9%和2 954.6 g/(m2·d).隨著SA的繼續(xù)加入，凝膠結(jié)構(gòu)被破壞，水蒸氣透過率再次降低，溶脹率也隨著結(jié)構(gòu)的破壞而降低.SA吸水性強(qiáng)，其大量加入會伴隨吸水能力的提高，故而水凝膠最終溶脹率重新升高，但其結(jié)構(gòu)無任何有效改變.

2.5 凝膠截面超微結(jié)構(gòu)分析

掃描電鏡觀察NSCS∶SA質(zhì)量比分別為1∶3和1∶6時(shí)的凝膠截面形態(tài)，結(jié)果如圖6，7所示.

圖6 m(NSCS)∶m(SA)=1∶3時(shí)凝膠掃描電鏡

圖7 m(NSCS)∶m(SA)=1∶6時(shí)凝膠掃描電鏡

m(NSCS)∶m(SA)=1∶3的凝膠截面結(jié)構(gòu)整齊有序，從而擴(kuò)大凝膠比表面積與水接觸面積，提高了溶脹率；微孔結(jié)構(gòu)多而分布均勻，能夠成為水迅速進(jìn)入水凝膠內(nèi)部的通道，且有利于水蒸氣的透過.m(NSCS)∶m(SA)=1∶6的凝膠截面因SA濃度過大導(dǎo)致結(jié)構(gòu)致密，幾無微孔，嚴(yán)重阻礙水蒸氣的透過.掃描電鏡結(jié)果與水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率分析結(jié)果一致，故m(NSCS)∶m(SA)=1∶3為水凝膠的最佳原料比值.

2.6 水凝膠皮膚刺激性評價(jià)

取新西蘭兔2只,雌雄各一，分籠飼養(yǎng).給藥前24 h將背部脊柱兩側(cè)去毛，3 cm×3 cm，左、右各兩組，分別作為完整皮膚和破損皮膚的實(shí)驗(yàn)組及對照組.用醫(yī)用棉球?qū)?shí)驗(yàn)組涂予共混水凝膠與生理鹽水，對照組涂予醫(yī)用凡士林，兩層紗布覆蓋，再以無刺激性醫(yī)用膠布進(jìn)行固定.持續(xù)6 h后除去藥物,觀察皮膚反應(yīng),并用溫水清洗給藥部位.給藥24 h后去藥并繼續(xù)觀察1，24，48，72 h皮膚有無紅斑和水腫現(xiàn)象，從無刺激到強(qiáng)刺激性，進(jìn)行量化評價(jià).

皮膚刺激性實(shí)驗(yàn)顯示，新西蘭兔破損皮膚對照組有輕微紅斑，而實(shí)驗(yàn)組0～72 h的刺激性評分均為0，未出現(xiàn)紅斑和水腫現(xiàn)象，初步證明該水凝膠無皮膚刺激性.

3 結(jié) 論

改進(jìn)NSCS合成工藝，在不使用吡啶，使用少量丙酮等有毒試劑的條件下合成低毒性NSCS產(chǎn)物，將其水溶性作為一項(xiàng)重要指標(biāo)，以反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、底物質(zhì)量比作為考察因素，采用單因素及正交實(shí)驗(yàn)得到最優(yōu)合成工藝，即底物質(zhì)量比1∶2，50 ℃溫度下反應(yīng)4 h.m(NSCS)∶m(SA)=1∶3情況下制備得到的NSCS/SA水凝膠溶脹率及水蒸氣透過率分別達(dá)到557.9%和2 954.6 g/(m2·d)，可知其吸附傷口滲透液能力強(qiáng)，透氣性好，且該水凝膠無皮膚刺激性.初步說明該水凝膠具有進(jìn)一步開發(fā)成一種優(yōu)良敷料的研究價(jià)值，而其對傷口愈合效果則有待進(jìn)一步的研究.

參考文獻(xiàn)：

[1]KEAN T， THANOU M． Biodegradation， biodistribution and toxicity of chitosan[J]． Adv Drug Deliver Rev，2010，62(1)：3-11．

[2]QIAO Ying， BAi Xue-fang， DU Yu-guang． Chitosan oligosaccharides protect mice from LPS challenge by attenuation of inflammation and oxidative stress[J]． Int Immunol，2011，11(1)：121-127．

[3]SUN Tao， ZHU Yun， XIE Jing， et al． Antioxidant activity of N-acyl chitosan oligosaccharide with same substituting degree[J]． Bioorg Med Chem Lett，2011，21(2)：798-800．

[4]HUANG Rong-hua， MENDIS E， RAJAPAKSE N， et al． Strong electronic charge as an important factor for anticancer activity of chitooligosaccharides (COS)[J]． Life Sci，2006，78(20)：2399-2408．

[5]賈建洪，許小豐，盛衛(wèi)堅(jiān)，等．接枝含氮雜環(huán)化合物殼聚糖的合成及其對重金屬離子的吸附[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，32(6)：639-642．

[6]錢俊青，呂堅(jiān)方．殼聚糖水凝膠的制備工藝對其吸附蛋白質(zhì)的影響[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(4)：395-398．

[7]KUMAR M N， MUZZARELLI R A， MUZZARELLI C， et al． Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J]． Chem Rev，2004，104(12)：6017-6084．

[8]易喻，江威，王鴻，等．羧甲基殼聚糖的制備及性能研究[J]．浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(1)：16-20．

[9]YING Guo-qing， XIONG Wen-yue， YI Yu， et al． Selective carboxypropionylation of chitosan： synthesis， characterization， blood compatibility， and degradation[J]． Carbohydrate Research，2011，346(10)：1217-1223．

[10]AZAD A K， SERMSINTHAM N， CHANDRKRACHANG S， et al． Chitosan membrane as a wound-healing dressing： characterization and clinical application[J]． J Biomed Mater Res B Appl Biomater，2004，69(2)：216-222．

[11]張步寧，崔英德，陳循軍，等．甲殼素，殼聚糖/甲殼素醫(yī)用敷料研究進(jìn)展[J]．化工進(jìn)展，2008，27(4)：20-26．

[12]柯林南，馮曉明，王春仁，等．醫(yī)用敷料研究的現(xiàn)狀與進(jìn)展[J]．中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(3)：521-524．