柱前衍生–高效液相色譜法測定白刺果中氨基酸含量*

杜平 ，王新風(fēng) ，馮輝 ，馬巍 ，富建

(1.吉林省伊通縣科學(xué)技術(shù)協(xié)會，吉林伊通 130700； 2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，長春 130033； 3.長春市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院，長春 130012)

白刺(nitraria)是蒺藜科(zygophyllceae)的旱生或超旱生典型沙漠植物，其抗逆性強，耐干旱鹽堿，是防風(fēng)固沙的優(yōu)良灌木［1-2］。白刺在全世界共有12個品種，我國有8種，主要分布在青海、新疆、甘肅、寧夏和內(nèi)蒙古等地［3］。白刺果實具有健胃補脾、滋陰潤肺、解表安神等功效［4］，是蒙、藏和維吾爾等少數(shù)民族的傳統(tǒng)藥材，廣泛用于多種疾病的治療，同時具有廣譜的營養(yǎng)作用［5］。

筆者對鄰苯二甲醛(OPA)和氯甲酸芴甲酯(FMOC)聯(lián)合柱前在線衍生、反相高效液相色譜(RP-HPLC)內(nèi)標(biāo)法快速測定白刺果中氨基酸含量進(jìn)行了研究。與傳統(tǒng)的氨基酸分析方法相比［6-11］，本方法具有樣品處理簡單、自動化程度高、分析時間短、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點，適合白刺果中氨基酸含量的測定。利用本方法對產(chǎn)自青海、新疆和內(nèi)蒙古3個地區(qū)的白刺果中氨基酸含量進(jìn)行測定，并對氨基酸含量及組成進(jìn)行分析比較，為其進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1100型，包括G1322A真空脫氣機、G1312A雙元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1330A自動進(jìn)樣器控溫裝置、G1316A柱溫箱、G1315B二極管陣列檢測器(DAD)和G1321A熒光檢測器(FLD)，美國Agilent公司；

實驗室高速粉碎機：A11型，德國IKA公司；

電熱恒溫干燥箱：最高溫度350℃，控溫精度±1℃，日本Yamato公司；

真空泵：DOA-V130-BN型，美國Waters公司；

臺式離心機：EBA21型，德國Hettich公司；

超聲波清洗器：KQ-2500B型，中國昆山超聲波儀器有限公司；

實驗室快速混勻器：Inchi HM-10型，日本Jircas公司；

甲醇、乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

NaH2PO4·H2O：分析純，美國 Sigma-Aldrich公司；

硼酸緩沖液：0.4 mol/L，pH 10.2，美國 Agilent公司；

鄰苯二甲醛(OPA)、氯甲酸芴甲酯(FMOC)：1 mL，美國Agilent公司；

OPA溶液：將10 mg OPA溶于1 mL 0.4 mol/L硼酸緩沖液中，搖勻；

FMOC溶液：2.5 mg FMOC 溶于1 mL乙腈中；

丙氨酸、精氨酸、天門冬氨酸、谷氨酸、組氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)混合液：濃度均為 1 mmol/L，介質(zhì)為 0.1 mol/L 的鹽酸溶液，美國Agilent公司；

內(nèi)標(biāo)戊氨酸：純度不小于99%，美國Sigma-Aldrich公司；

巰基乙醇：分析純，北京化學(xué)試劑廠；

實驗用水為超純水；

白刺果樣品：風(fēng)干樣品，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所。

1.2 溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液配制：準(zhǔn)確稱取適量戊氨酸，用0.1 mol/L HCl配制成濃度為50 mmol/L的內(nèi)標(biāo)儲存液，臨用時稀釋。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液配制：將濃度為1 mmol/L的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋至不同濃度，再與適當(dāng)濃度的戊氨酸內(nèi)標(biāo)溶液按一定比例混合，配制成濃度分別為 4.5，45，225，450，900 μmol/L 的 17 種氨基酸(內(nèi)標(biāo)戊氨酸濃度均為250 μmol/L)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品處理

將風(fēng)干樣品置于(65±1)℃烘箱中烘干24 h左右，至恒重。將烘干后的樣品粉碎(粒徑約250 μm)后，置于棕色廣口瓶中備用。樣品水解采用酸水解方法，具體步驟如下：準(zhǔn)確稱取30 mg粉碎后樣品于具螺旋蓋的水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl、125 μL 50 mmol/L 的內(nèi)標(biāo)溶液和 100 μL 巰基乙醇，混勻。向水解管中沖氮氣2 min，完全置換出其中的空氣，封蓋。將密封好的水解管放入烘箱內(nèi)，于(110±1)℃水解22～24 h。取出冷卻至室溫，過濾至25 mL容量瓶內(nèi)，用5 mol/L NaOH溶液調(diào)至pH 1左右，加水定容。取定容后的水解液1 mL于離心管內(nèi)，在14 000 r/min下離心15 min，吸取0.5 mL左右上清液于HPLC樣品瓶中，待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Zorbax Eclipse AAA C18柱(75 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國Agilent公司)；流動相：A為40 mmol/L NaH2PO4溶液，pH 7.8；B為乙腈-甲醇-水(體積比為4.5∶4.5∶1)；流動相梯度洗脫程序：0.0～1.0 min(B ：0%)，1.0～9.8 min(B ：0%～57%)，9.8～10.0 min(B ：57%～100%)，10.0～12.0 min (B ：100%)，12.0～12.5 min(B ：100%～0%)，12.5～14.0 min(B：0%)；流速：2 mL/min；柱溫：40℃；DAD檢測波長：0.0～8.5 min時，紫外波長為338 nm(譜帶寬為10 nm)，參考波長為390 nm(譜帶寬為20 nm)；FLD檢測波長：0.0～8.5 min(激發(fā)波長為340 nm，發(fā)射波長為450 nm)，8.5～14.0 min(激發(fā)波長為266 nm，發(fā)射波長為305 nm)；自動衍生程序：分別吸取2.5 μL硼酸緩沖液和0.5 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品水解液，充分混合，靜置30 s，洗針，吸取0.5 μL OPA溶液充分混合，洗針，吸取0.5 μL FMOC溶液充分混合，吸取32 μL水，充分混合；進(jìn)樣體積：18 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

蛋白質(zhì)在酸水解過程中影響氨基酸測定準(zhǔn)確度的干擾物質(zhì)較多(如碳水化合物、脂肪等)，通常是在水解前將其除去。但是這樣不但使操作繁瑣，同時也會引入誤差。筆者將水解方法進(jìn)行了改進(jìn)，即在水解前加入已知濃度的內(nèi)標(biāo)物戊氨酸來校正蛋白質(zhì)在水解過程中的物理和化學(xué)損失，同時簡化了操作步驟。選擇戊氨酸的原因是首先它不存在于天然蛋白質(zhì)中，并且與組成蛋白質(zhì)的氨基酸化學(xué)性質(zhì)相近，其次在色譜分離過程中又能與其它氨基酸很好地分離。色譜圖見圖1。

圖1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(a，b)與樣品溶液(c，d)色譜圖

水解液的處理采用加堿中和法，省去了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)趕酸和濃縮等繁瑣的操作步驟，同時也減少了誤差來源，使測定結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.2 色譜條件的選擇

OPA和FMOC都是常用的氨基酸衍生試劑，將兩者聯(lián)合使用，提高了衍生效率。衍生過程利用自動進(jìn)樣器按1.4的自動衍生程序來完成，可以提高自動化程度和重現(xiàn)性。但應(yīng)該注意的是OPA在空氣中不穩(wěn)定，易氧化降解而失效，建議每3 d更換一次，若長期不用應(yīng)注意隔絕空氣并且低溫冷凍保存。而FMOC具有揮發(fā)性且有微弱毒性，使用時需謹(jǐn)慎操作。

本研究使用DAD和FLD聯(lián)合檢測氨基酸的衍生物，可同時測定16種氨基酸含量。使用FLD檢測(圖1 b、圖1 d)時雜質(zhì)干擾小，基線平穩(wěn)，檢測靈敏度比DAD高10倍以上，但是賴氨酸在熒光檢測器上響應(yīng)值較小，需要使用DAD檢測器檢測(圖1 a、圖 1 c)。

HPLC法測定氨基酸的分析時間一般需要30 min，而采用經(jīng)典的氨基酸分析儀法分析時間需1 h左右。實驗采用反相C18短柱(75 mm)和高壓二元梯度大流量洗脫測定氨基酸，將1次進(jìn)樣分析時間縮短至14 min，大大提高了分析效率。

2.3 線性方程與檢出限

將1.2中配制的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液，按1.4的色譜條件依次進(jìn)行測定，以各氨基酸峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，氨基酸濃度(X，μmol/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸得到回歸方程，各氨基酸濃度在4.5～900 μmol/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r在0.991 2～0.999 8之間。以信噪比S/N=3計算檢出限(LOD)，結(jié)果見表1。由于賴氨酸是使用DAD檢測器，所以比其它氨基酸的檢測靈敏度低。

表1 線性方程、線性范圍與檢出限

2.4 回收試驗與精密度試驗

準(zhǔn)確稱取已知氨基酸含量的同一樣品5份，按與氨基酸含量相當(dāng)?shù)臐舛燃尤氚被針?biāo)準(zhǔn)液，測定其回收率，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，各氨基酸的回收率，除蛋氨酸為78.1%(部分被氧化破壞)外，其它在93.1%～105.1%范圍內(nèi)，RSD為3.21%～6.23%。說明該方法準(zhǔn)確度和精密度較高。

表2 回收試驗與精密度試驗結(jié)果(n=5)

2.5 實際樣品測定

對分別產(chǎn)自青海、新疆和內(nèi)蒙古等3個地區(qū)的白刺果中的氨基酸含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。3個地區(qū)白刺果中氨基酸總量分別為11.23，10.47，8.84 g/(100 g)，其中內(nèi)蒙古地區(qū)白刺果氨基酸含量最低，青海地區(qū)含量最高；3個地區(qū)白刺果中必需氨基酸和半必需氨基酸(組氨酸、蘇氨酸、精氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和賴氨酸)之和分別占總量的53.61%，56.26%和53.39%；芳香族氨基酸(酪氨酸和苯丙氨酸)分別占總量的12.20%，10.60%和12.90%；增香族氨基酸(精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和脯氨酸)分別占總量的48.44%、46.99%和43.55%；輸液氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和賴氨酸)分別占總量的66.52%，57.50%和61.20%；酸性氨基酸(天冬氨酸和谷氨酸)分別占總量的20.57%，19.20%和20.48%；堿性氨基酸(組氨酸、精氨酸和賴氨酸)分別占總量的18.61%，18.43%和16.86%；中性氨基酸(絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和脯氨酸)分別占總量的60.82%，62.37%和62.67%；結(jié)果表明：雖然氨基酸總量因白刺果的產(chǎn)地不同而存在一定差異，但是各種不同類型氨基酸所占氨基酸總量的比例差別不大。

表3 不同產(chǎn)地干基白刺果氨基酸含量測定結(jié)果 g/(100 g)

3 結(jié)論

采用OPA和FMOC聯(lián)合柱前在線自動衍生，反相C18色譜柱分離、二元梯度洗脫、DAD和FLD聯(lián)合檢測的高效液相色譜法測定白刺果中氨基酸含量。結(jié)果表明：本方法與傳統(tǒng)氨基酸分析方法相比，具有樣品前處理簡單(無需預(yù)先去除干擾物質(zhì)以及對水解液進(jìn)行蒸發(fā)趕酸)，靈敏度、準(zhǔn)確度高，分析時間短(僅14 min)等優(yōu)點。用該法對產(chǎn)自青海、新疆和內(nèi)蒙古3個不同產(chǎn)地白刺果氨基酸含量進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地白刺果氨基酸總量存在一定差異，但是各種不同類型氨基酸占總量的比例相當(dāng)。

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