活體示蹤干細(xì)胞治療心肌梗死的分子影像技術(shù)進(jìn)展

覃杰 單鴻

近年來使用干細(xì)胞移植治療心肌梗死已取得可喜的成績，但對干細(xì)胞移植治療后干細(xì)胞的分布、歸巢及分化等所知甚少[1-2]。若不能進(jìn)一步了解移植后干細(xì)胞的分布、歸巢及分化，將不能揭示干細(xì)胞治療心肌梗死的機(jī)制，阻礙干細(xì)胞移植治療在臨床的應(yīng)用。了解干細(xì)胞分布、歸巢及分化的最好方法是通過分子影像技術(shù)活體示蹤干細(xì)胞[2]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，分子影像技術(shù)也得到了不斷發(fā)展?；铙w示蹤干細(xì)胞的分子影像技術(shù)已成為干細(xì)胞移植治療的研究熱點(diǎn)。本文將詳細(xì)介紹示蹤干細(xì)胞治療心肌梗死的多種分子影像技術(shù)的最新進(jìn)展，探討其優(yōu)缺點(diǎn)以及臨床適用性。

一、示蹤干細(xì)胞的分子影像技術(shù)

活體示蹤移植干細(xì)胞分布及分化將有助于干細(xì)胞移植治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)及臨床研究的發(fā)展。示蹤干細(xì)胞的分子影像技術(shù)有MRI、放射性核素成像、報(bào)告基因成像、光學(xué)成像以及高效有機(jī)整合幾種成像技術(shù)為一體的多模態(tài)成像。

1.MRI

MRI是通過使用順磁性對比劑來評價(jià)心臟結(jié)構(gòu)和功能的最好技術(shù)[3]。MRI具有良好的空間 [10～100 μm(小動(dòng)物磁共振)，500～1 500 μm(臨床)]和時(shí)間分辨率，可示蹤標(biāo)記超順磁和順磁性對比劑的干細(xì)胞[3]。磁共振光譜成像(如19F MRI)亦可示蹤移植心肌的干細(xì)胞[4]。

1.1超順磁性氧化鐵納米顆粒

Arbab等[6]報(bào)道SPIO不影響細(xì)胞的活力、增殖、分化和遷移。然而,Schafer等[7]卻發(fā)現(xiàn)SPIO會減少間充質(zhì)干細(xì)胞移植和增殖能力以及干擾細(xì)胞功能等問題。SPIO可存在標(biāo)記的干細(xì)胞內(nèi),亦可存在吞噬死亡干細(xì)胞的單核細(xì)胞內(nèi)，因此無法根據(jù)MRI低信號來判斷SPIO位于干細(xì)胞內(nèi)還是單核細(xì)胞內(nèi)[8]。此外,SPIO引起的低信號亦無法與含鐵血黃素等血液衍生物引起的低信號相鑒別[9]。Winter等[10]報(bào)道MRI不能區(qū)別心肌內(nèi)存活的干細(xì)胞及被巨噬細(xì)胞吞噬的死亡的干細(xì)胞。同樣, Terrovitis等[11]認(rèn)為MRI高估了SPIO標(biāo)記的移植心臟的干細(xì)胞的存活情況。

1.2順磁離子

釓(Gd)螯合物和錳(Mn)氯化合物等陽性對比劑標(biāo)記的細(xì)胞在T1上表現(xiàn)為低信號。相對于SPIO，MRI對Gd標(biāo)記的細(xì)胞的敏感度較低，因?yàn)镚d降低細(xì)胞內(nèi)易與離子螯合的水濃度而降低弛豫效能[12]。此外,在溶酶體和內(nèi)涵體內(nèi)低pH的環(huán)境下，釓螯合物可能迅速去螯合而游離出可引起生物安全問題的Gd3+離子[12]。

氯化錳(MnCl2)和SPIO一樣可標(biāo)記和示蹤干細(xì)胞，并有望提高M(jìn)RI活體示蹤干細(xì)胞的敏感性[13-14]。Yamada等[13]指出MRI可示蹤亞毫摩爾濃度MnCl2標(biāo)記的干細(xì)胞及活體評價(jià)MnCl2標(biāo)記的干細(xì)胞活性。已有新型納米對比劑如碳釓納米管(Gadonanotubes)用于示蹤干細(xì)胞,其降低T1弛豫效能好于目前已知的對比劑(為Gd對比劑40倍)[15]。若這些納米對比劑被證實(shí)無毒，其定會在將來的分子影像中發(fā)揮重要作用。

1.319F MRI

雖然19F MRI尚未廣泛應(yīng)用于臨床,但19F的一些特性可使19F MRI成為示蹤干細(xì)胞治療心肌梗死的較好方法之一；由于正常生物體內(nèi)不含有19F，故19F MRI信號均來自外源對比劑,如全氟化碳粒子或氟化核苷；由于19F和1H旋比率僅差6%，故19F MRI可使用現(xiàn)有的1H MRI成像硬件[16]。

除了能像1H高選擇性、高分辨率示蹤移植干細(xì)胞外，19F還可定量檢測細(xì)胞。Partlow等[17]已證實(shí)19F MRI能特異性識別、定位和定量干細(xì)胞。雖然19F示蹤細(xì)胞已成為研究熱點(diǎn),但其仍處于發(fā)展的初期階段，具有敏感度低、成像時(shí)間長的缺點(diǎn)。Srinivas等[16]試圖通過完善成像硬件、成像序列及標(biāo)記方法等來克服19F MRI的缺點(diǎn)，使其在示蹤干細(xì)胞中發(fā)揮越來越重要的作用。

2.放射性核素成像

放射性核素成像包括正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像(PET)及單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)。放射性核素成像具有靈敏度高(10-10～10-12mol/L vs 10-3～10-5mol/L MRI)及定量測量干細(xì)胞的優(yōu)點(diǎn)，但也有一些缺點(diǎn)[18]：①空間分辨率(1～2 mm)低于MRI[18]。②僅適用于短期示蹤干細(xì)胞，因?yàn)橛糜跇?biāo)記干細(xì)胞的放射性物質(zhì)的半衰期較短[如：18F:110 min；111In(銦):2.8天；99 mTc(锝):6 h][19]。③核素的輻射會減弱細(xì)胞活力及增殖。如111In可發(fā)射引起生物副反應(yīng)的Auger 電子。Brenner等[20]報(bào)道在移植干細(xì)胞術(shù)后48 h內(nèi)盡管干細(xì)胞能進(jìn)入梗死區(qū)域，但111In標(biāo)記的干細(xì)胞的活性、增殖及分化明顯受到抑制。Nowak等[21]報(bào)道小鼠造血祖細(xì)胞即使暴露于較低水平的放射性物質(zhì)亦受到損害。

PET比SPECT具有更高的靈敏度(2到3個(gè)數(shù)量級)和更好的空間和時(shí)間分辨率。18F脫氧葡萄糖(18F-FDG)已用于標(biāo)記細(xì)胞以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的短期示蹤干細(xì)胞。不管經(jīng)過冠狀動(dòng)脈注射何種類型的干細(xì)胞及數(shù)量多少的干細(xì)胞，PET觀察到的移植效果都不理想，在所有經(jīng)過靜脈注射干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，PET均沒能在心肌內(nèi)檢測到標(biāo)記的細(xì)胞[22-23]。

PET-CT具有更高的靈敏性,可非侵襲性顯示冠狀動(dòng)脈解剖結(jié)構(gòu)及示蹤干細(xì)胞。這種多模態(tài)成像可解決18F短半衰期問題。Lang等[24]建議使用半衰期更長的同位素,如64Cu(12.7 h)。

3.報(bào)告基因成像

報(bào)告基因是一種編碼可被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。報(bào)告基因成像將報(bào)告基因與探針(光學(xué)、核素、磁共振)結(jié)合在一起,通過探針顯像報(bào)告基因產(chǎn)物的活性水平從而間接提供報(bào)告基因表達(dá)水平及驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因表達(dá)的內(nèi)源性信號或轉(zhuǎn)錄因子水平的信息[25]。報(bào)告基因成像具有特異性識別存活細(xì)胞(包含基因產(chǎn)物)和中長期示蹤干細(xì)胞(解決了探針隨細(xì)胞增殖而被稀釋的問題)的優(yōu)點(diǎn)[25-26]。

報(bào)告基因成像已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中。單純皰疹病毒1型胸苷激酶 (HSV1-tk)及其突變體(HSV1-sr39tk)是目前使用最廣泛的放射性核素成像示蹤報(bào)告基因[25-26]。單純皰疹病毒的tk與哺乳動(dòng)物的不同,其通過高效磷酸化嘌呤及嘧啶核苷酸捕獲配體。常用的HSV1-tk底物有：尿嘧啶核苷衍生物，如FIAU和FEAU；無環(huán)鳥苷類衍生物，如18F-羥甲基丁基鳥嘌呤(FHBG)和18F-羥丙基甲基鳥嘌呤(FHPG)。HSV1-sr39tk能更有效地利用無環(huán)鳥苷衍生物，標(biāo)記探針的Vmax/Km值更高，成像效果更佳。因此，HSV1-sr39tk-18F-FHBG是目前最有效的PET報(bào)告基因。

Wu等[27]首先使用報(bào)告基因成像示蹤移植心臟的干細(xì)胞。他們用18F-FHBG PET或生物發(fā)光成像(BLI)活體示蹤治療心肌梗死的干細(xì)胞(表達(dá)HSV1-sr39tk或熒光素酶)2周[27]。此外,Cao等[28]報(bào)道使用PET、BLI和熒光成像的三融合報(bào)告基因可觀察小鼠胚胎干細(xì)胞(ESC)的生存和增殖。

雖然HSV-tk基因成像敏感性高，但由于免疫原性可能會限制其應(yīng)用于人類。 Ponomarev等[29]提出使用人類線粒體胸苷激酶2型(hTK2)可克服免疫原性的問題。此外，人鈉/碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(hNIS)與124I 或99mTc合用可分別作為PET或SPECT報(bào)告基因[13,25]。 由于hNIS可在除心臟以外的器官(如甲狀腺、胃、唾腺和脈絡(luò)叢等)表達(dá)，因此hNIS無免疫原性，hNIS成像不需要合成復(fù)雜的探針[13,25]。

β-半乳糖苷酶、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體、鐵蛋白及高賴氨酸蛋白等均可作為MRI報(bào)告基因[30]。Naumova等[31]用MRI示蹤表達(dá)鐵蛋白的成肌細(xì)胞，但信號衰減高達(dá)25%，第3周后MRI已無法檢測到信號。因此，目前活體MRI基因成像尚無法長期示蹤干細(xì)胞。

報(bào)告基因成像示蹤干細(xì)胞治療心肌梗死尚存一些問題[32-33]。首先,報(bào)告基因表達(dá)的蛋白質(zhì)可能會影響干細(xì)胞的一些細(xì)胞功能和治療效果。其次,報(bào)告基因與宿主細(xì)胞染色質(zhì)融合是否會導(dǎo)致基因突變而存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)，仍存在爭議。

4.光學(xué)成像

4.1BLI

BLI是熒光素酶基因標(biāo)記的細(xì)胞或DNA在ATP及氧氣存在的條件下表達(dá)熒光素酶, 熒光素酶氧化探針(D熒光素)發(fā)光,從而能夠直接檢測活體內(nèi)的細(xì)胞活動(dòng)和基因行為[27]。BLI已廣泛應(yīng)用于示蹤干細(xì)胞移植治療的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[27-28]。BLI的優(yōu)點(diǎn)是無創(chuàng)、靈敏度高、可定量分析、操作簡單等，缺點(diǎn)是信號較弱、檢測時(shí)間較長、實(shí)驗(yàn)設(shè)備成本高及細(xì)胞或基因需要轉(zhuǎn)基因標(biāo)記等[18,27]。

4.2熒光成像

熒光成像是通過激發(fā)光激發(fā)熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP, Cyt及dyes等)到達(dá)高能量狀態(tài)后發(fā)光而成像[34]。近紅外成像的出現(xiàn)促進(jìn)了活體及離體監(jiān)測干細(xì)胞的發(fā)展[27,34]。近紅外成像通過減少光吸收和組織散射來增強(qiáng)信號穿透能力，因此其可斷層成像。目前近紅外成像限用于表淺器官成像及示蹤干細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，將來其有可能應(yīng)用于臨床。Ly等[34]已成功在豬心肌梗死模型中示蹤近紅外染料IR-786標(biāo)記的MSC，靈敏度可達(dá)10 000細(xì)胞。量子點(diǎn)是一種無機(jī)的熒光納米粒子,已成功用于標(biāo)記干細(xì)胞[35]。MSC的體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)已證明量子點(diǎn)具有較低生物相容性，不影響細(xì)胞活性、增殖或分化[35-36]。量子點(diǎn)可標(biāo)記干細(xì)胞分化過程中的多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，因此量子點(diǎn)有助于系統(tǒng)、深入地研究MSC的分化機(jī)制及調(diào)控干細(xì)胞的分化。Muller-Borer等[35]利用磁性/熒光量子點(diǎn)雙功能納米粒子成功標(biāo)記大鼠干細(xì)胞,標(biāo)記效率達(dá)90%以上。量子點(diǎn)對干細(xì)胞功能的長期影響尚不為人知,應(yīng)關(guān)注其金屬芯[鉛、鎘(Cd)和硒(Se)等]的暴露或溶解可能會導(dǎo)致的中毒[37]。

5.多模態(tài)成像

多模態(tài)成像是將敏感度高的光學(xué)成像和放射性核素成像以及解剖分辨率高的MRI等分子影像技術(shù)高效地整合成一體的成像技術(shù)。越來越多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已應(yīng)用多模態(tài)成像技術(shù)，并取得較好成績。Qiao等[38]將已傳染HSV1-sr39tk及標(biāo)記SPIO的小鼠ESC注入健康或梗死心肌4周后，通過多模態(tài)成像可評估移植細(xì)胞的生存和增殖。Qiao等[38]發(fā)現(xiàn)ESC的存活及增殖在PET表現(xiàn)為18F-FHBG攝取增加，在MRI上由于SPIO被稀釋表現(xiàn)為低信號區(qū)縮小，4周后多數(shù)SPIO存在于局部浸潤的巨噬細(xì)胞內(nèi)而非ESC內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示ESC移植能略改善左心功能，但改善心功能的機(jī)制是旁分泌作用而非心肌細(xì)胞的增多,因?yàn)橹挥猩儆?.5%的ESC分化為心肌細(xì)胞[38-39]。Higuchi等[40]用已傳染hNIS報(bào)告基因及標(biāo)記SPIO的人臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞移植治療心肌梗死3天后，PET未能檢測到124I，但MRI低信號可持續(xù)存在，說明移植細(xì)胞在短期內(nèi)大量死亡，巨噬細(xì)胞吞噬死亡的SPIO標(biāo)記的移植細(xì)胞。多模態(tài)成像的研究熱點(diǎn)及重點(diǎn)是如何更有效地有機(jī)整合各種分子影像技術(shù)，使其在未來活體示蹤干細(xì)胞的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究中發(fā)揮重要的作用。

二、總 結(jié)

雖然已有不少較好的示蹤干細(xì)胞的分子影像技術(shù)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用,但仍需不斷完善才能應(yīng)用于臨床。除了具有爭議的安全和倫理問題外,尚有以下懸而未決的關(guān)鍵問題：“最好的移植路徑是什么?”“用何種細(xì)胞和用多少細(xì)胞移植?”及“何時(shí)移植?”。

顯然,目前無單一的最佳分子影像技術(shù)示蹤干細(xì)胞，因此最好能將具有靈敏度高(光學(xué)成像)、空間分辨率高(MRI)和功能成像(PET)的各種分子影像技術(shù)高效有機(jī)地整合為一體，構(gòu)建多模態(tài)成像。未來分子影像技術(shù)應(yīng)具有更高敏感度及特異度，更少免疫原性和致瘤性，以及更好藥代動(dòng)力學(xué)特性。

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