乙酰膽堿酯酶與新型香豆素類(lèi)二聚體抑制劑的作用研究

王金虎,畢海燕

(棗莊學(xué)院 化學(xué)化工與材料科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160)

0 引言

阿爾茨海默氏病(Alzheimer disease, AD)是一種常見(jiàn)的與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性認(rèn)知功能障礙的疾病，其特征是記憶力減退，神經(jīng)性精神和行為障礙.AD發(fā)病率較高，死亡率僅次于心血管病、癌癥及中風(fēng)而位居第四[1]，已成為現(xiàn)代社會(huì)嚴(yán)重威脅老年人健康和生命的疾病之一.對(duì)癥治療阿爾茨海默氏病的藥物主要是一類(lèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)類(lèi)藥物，通過(guò)提升中樞膽堿功能，來(lái)抑制乙酰膽堿的降解[2].乙酰膽堿(ACh)是一種促進(jìn)思維活躍的神經(jīng)遞質(zhì)，AD患者腦內(nèi)ACh的減少是認(rèn)知和記憶功能損傷的直接原因.現(xiàn)在市場(chǎng)上治療AD的藥物有五類(lèi)，其中四個(gè)(他克林，多奈哌齊，卡巴拉汀，加蘭他敏)是乙酰膽堿酯酶抑制劑(AChEIs)[3-6]，而美金剛是N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDA)拮抗劑.但是，所有這些藥物在治療過(guò)程中存在副作用，長(zhǎng)時(shí)間服用藥物效力會(huì)減弱[7].由于AD病因的復(fù)雜多樣性，AChEIs等傳統(tǒng)單靶向抗AD藥物只在一定程度上緩解中、輕度AD患者的病癥，并不能終止和逆轉(zhuǎn)AD的病情進(jìn)展.因此近10多年來(lái)新型多靶向抗AD藥物的研發(fā)日益成為本領(lǐng)域的研究熱點(diǎn).目前對(duì)癥治療阿爾茨海默氏病的藥物主要屬于一類(lèi)含乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑的藥物.

通過(guò)文獻(xiàn)閱讀在文獻(xiàn)[8-9]中收集了十九種表現(xiàn)出結(jié)構(gòu)多樣性的香豆素類(lèi)二聚體化合物作為配體分子(如圖1)，以考察不同取代基對(duì)二聚體類(lèi)抑制劑與乙酰膽堿酯酶復(fù)合構(gòu)象的影響.本文選用來(lái)自老鼠類(lèi)乙酰膽堿酯酶晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 1N5M) 作為分子模擬研究中的受體.

1 研究方法

為了得到香豆素二聚體類(lèi)配體分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，應(yīng)用Gaussian 03 程序包[10]中密度泛函方法在6-31G(d) 水平下對(duì)二聚體類(lèi)分子1-19進(jìn)行構(gòu)型優(yōu)化，結(jié)果如圖1所示.優(yōu)化結(jié)束后選取能量低的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象用于分子對(duì)接研究.應(yīng)用AutoDock 4.0軟件[11]對(duì)配體1-19和AChE受體進(jìn)行分子對(duì)接對(duì)接.對(duì)接過(guò)程中，應(yīng)用ADT中的Ligand 模塊設(shè)置配體分子的自由度.計(jì)算中用來(lái)代表受體的grid maps 采用AutoGrid 程序計(jì)算.AChE受體分子由于包括兩個(gè)活性位點(diǎn)，一個(gè)為正常的活性區(qū)域，另一個(gè)為外周陰離子活性區(qū)域；為使grid 盒子能夠完全包含活性位點(diǎn)及其周?chē)牡鞍讌^(qū)域，本文依次選取格點(diǎn)盒子的大小為60?×30?×68?；每個(gè)香豆素二聚體類(lèi)分子均進(jìn)行40次獨(dú)立的對(duì)接運(yùn)算，對(duì)接結(jié)果根據(jù)構(gòu)象差異按照均方根偏差(RMSD)值等于0.5 ?為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分組，并依據(jù)結(jié)合自由能的大小對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估.對(duì)每個(gè)香豆素二聚體類(lèi)小分子，選取含有最多對(duì)接構(gòu)象的分組中對(duì)接能量最低的構(gòu)象作為該抑制劑分子的活性構(gòu)象.

圖1 十九種香豆素二聚體類(lèi)抑制劑分子

圖2 十九種香豆素二聚體類(lèi)小分子優(yōu)化結(jié)構(gòu)

2 結(jié)果和討論

2.1 分子對(duì)接數(shù)據(jù)圖像分析

分組結(jié)果表明，在每個(gè)香豆素二聚體類(lèi)分子的40次獨(dú)立對(duì)接結(jié)果中，十九種香豆素類(lèi)二聚體小分子均主要以一種結(jié)合方式(構(gòu)象所占比例≥ 80%)與受體發(fā)生相互作用.Autodock 計(jì)算的能量項(xiàng)包括分子間作用能(包括范德華相互作用能、氫鍵相互作用能、去溶劑化能和靜電相互作用能)，內(nèi)能和分子扭轉(zhuǎn)能.其中前兩項(xiàng)之和為對(duì)接能(Docking energy)，第一和第三項(xiàng)之和為結(jié)合能(Binding energy)，對(duì)接的能量信息見(jiàn)表1.

正?；钚晕稽c(diǎn)由殘基Ser203、Glu334和His447組成，外周陰離子活性位點(diǎn)是由His287、Tyr72、Tyr441和Glu292組成.當(dāng)香豆素類(lèi)二聚體小分子1、2、3、4、5、6、7、9、11、12、13、18和19在正常活性位點(diǎn)以及二聚體小分子5在外周陰離子活性位點(diǎn)的結(jié)合能均為正值，說(shuō)明這種抑制劑不能與目標(biāo)蛋白質(zhì)對(duì)接，即使它在電腦模擬計(jì)算過(guò)程中出現(xiàn)了氫鍵，結(jié)合能仍然為正值，所以在表1中沒(méi)有出現(xiàn)這幾組的數(shù)據(jù).

在對(duì)接計(jì)算的所有能量中，二聚體小分子配體和蛋白酶之間的氫鍵作用模式最為關(guān)鍵，它直接決定了抑制劑是否能起到抑制作用以及抑制作用的強(qiáng)弱，而配體特定基團(tuán)的疏水作用則可以很大程度上影響抑制劑的特異性[12-15].分子對(duì)接得到的分子與活性口袋及其相鄰殘基的作用方式見(jiàn)圖3和4.通過(guò)對(duì)接構(gòu)象與AChE之間氫鍵作用模式上的差異及圖像的研究，可以將對(duì)接構(gòu)象分為三類(lèi)：(a)以二聚體小分子中6、7號(hào)位取代基的部分氧原子與AChE發(fā)生氫鍵相互作用的構(gòu)象；(b)氫鍵位于二聚體小分子中的內(nèi)酯基與AChE的活性口袋殘基之間；(c)以二聚體小分子中3號(hào)位取代基的部分氧原子、氮原子與AChE發(fā)生氫鍵相互作用的構(gòu)象.由于不同的香豆素分子可以具有相同的結(jié)合模式，因此圖3中給出了抑制劑8、14、15和16的在正?；钚晕稽c(diǎn)對(duì)接構(gòu)象以作代表；圖4給出了抑制劑3、9、11和13在外周陰離子活性位點(diǎn)區(qū)域?qū)拥膶?duì)接構(gòu)象作為代表.

表1 對(duì)接得到的二聚體分子與AChE之間的結(jié)合能和對(duì)接能

圖3 抑制劑8、14、15和16的在正常活性位點(diǎn)區(qū)域?qū)拥膶?duì)接構(gòu)象

圖4 抑制劑3、9、11和13在外周陰離子活性位點(diǎn)區(qū)域?qū)拥膶?duì)接構(gòu)象

圖3a給出了抑制劑8和受體蛋白AChE的正?；钚晕稽c(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象.可以看到抑制劑8與活性口袋之間形成了五個(gè)氫鍵相互作用，即抑制劑8的內(nèi)酯區(qū)O13分別與Gly121的HN、Gly122的HN和Ser203的HG形成鍵長(zhǎng)分別為1.941?、2.170?和1.758?的氫鍵；N20與Try124的OH形成長(zhǎng)度為2.445?的氫鍵；O8與Glu202的OE1形成長(zhǎng)度為2.879 ?的氫鍵.此構(gòu)象反映了內(nèi)酯區(qū)氧原子與蛋白質(zhì)殘基形成氫鍵占主導(dǎo)地位.

圖3b顯示的是抑制劑14和AChE的正?；钚晕稽c(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象.其中抑制劑14的O11與Ser203的HG之間形成了長(zhǎng)度為2.089?的氫鍵.香豆素類(lèi)二聚體抑制劑小分子兩端的二元環(huán)和苯環(huán)則位于疏水區(qū)域，由于苯環(huán)和二元環(huán)本身也是疏水的，這種結(jié)合模式對(duì)抑制劑與目標(biāo)蛋白的結(jié)合有利.圖3c呈現(xiàn)了抑制劑15和AChE的正?；钚晕稽c(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象.從構(gòu)象得出抑制劑15的N18與AChE的殘基Glu202的OE1之間形成了長(zhǎng)度為2.327?的氫鍵，形成氫鍵位置位于蛋白質(zhì)殘基組成的親水區(qū)域，這種構(gòu)象不利于抑制劑在結(jié)合口袋的結(jié)合.圖3d給出了抑制劑16和AChE的正?；钚晕稽c(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象.可以看到抑制劑16與AChE殘基之間形成了兩個(gè)氫鍵，即抑制劑16的O46分別與Gly122和Ala204的HN形成鍵長(zhǎng)分別為1.728?和2.075?的氫鍵.由于氫鍵的形成致使抑制劑的疏水的二元環(huán)部分位于親水區(qū)，此構(gòu)象不利于抑制劑的結(jié)合.

圖4給出的是抑制劑3、9、11和13位于AChE的外周陰離子活性位點(diǎn)時(shí)抑制劑和結(jié)合蛋白之間的相互作用.和正?；钚晕稽c(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象不同的是，這些抑制劑主要利用其內(nèi)酯區(qū)原子和外周陰離子活性位點(diǎn)處殘基相互作用，作用形式也主要是氫鍵相互作用.如抑制劑3的內(nèi)酯區(qū)O13與AChE殘基Arg296的O和Arg296的HN之間形成了長(zhǎng)度為2.962?和2.175?的氫鍵(圖4a)；抑制劑9的內(nèi)酯區(qū)O10與AChE殘基Arg296的O和Arg296的HN之間形成了長(zhǎng)度為2.946?和1.995?的氫鍵(圖4b)；抑制劑11的內(nèi)酯區(qū)O11與AChE殘基Arg296的HN之間形成了長(zhǎng)度為1.947?的氫鍵(圖4c).特別需要指出的是抑制劑13與AChE殘基之間形成了三個(gè)氫鍵，即抑制劑13的H45與Leu289的O形成鍵長(zhǎng)為2.143?的氫鍵；內(nèi)酯區(qū)O12與O13分別與1N5M殘基Arg296的HN之間形成了長(zhǎng)度為2.140?和2.175?的氫鍵(圖4d).圖4a、b、c和d呈現(xiàn)的抑制劑和AChE的外周陰離子活性位點(diǎn)相互作用的對(duì)接構(gòu)象都具有相同的特點(diǎn)，首先氫鍵的形成大都是由抑制劑內(nèi)酯區(qū)氧原子與結(jié)合位點(diǎn)殘基作用形成的；其次抑制劑的二聚體環(huán)大部分位于殘基組成的疏水區(qū)，內(nèi)酯區(qū)則位于殘基組成的親水區(qū)，這有利于抑制劑與AChE的結(jié)合.通過(guò)對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，部分抑制劑有兩個(gè)負(fù)電性中心：抑制劑母體的內(nèi)脂區(qū)和6位或7位的芐基區(qū).由于這兩部分負(fù)電作用比較強(qiáng)極易與周?chē)鞍踪|(zhì)發(fā)生靜電作用，從而導(dǎo)致氫鍵的形成.為了更清楚地認(rèn)識(shí)對(duì)接結(jié)果中的二聚體類(lèi)分子在AChE的活性口袋內(nèi)部取向上的差異，本文對(duì)二聚體分子的對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行了疊加，見(jiàn)圖5和圖6.由圖可知，根據(jù)二聚體小分子的母體取向可以將其分為三類(lèi)：抑制劑8和15在正?；钚晕稽c(diǎn)區(qū)域?qū)訒r(shí)分子取向相似為第一類(lèi)，這一類(lèi)中的化合物與疏水性殘基距離較遠(yuǎn)；抑制劑14和16在正?；钚晕稽c(diǎn)區(qū)域?qū)訒r(shí)的所有對(duì)接構(gòu)象母體取向相同，屬于第二類(lèi)，抑制劑3、9、11和13在外周陰離子活性位點(diǎn)區(qū)域?qū)訒r(shí)構(gòu)象一致和母體取向一致為第三類(lèi).

圖5 (a)抑制劑8、14、15和16在正?；钚晕稽c(diǎn)對(duì)接的對(duì)接構(gòu)象在乙酰膽堿酯酶表面的疊加.表面由活性口袋殘基周?chē)?0 ?范圍內(nèi)的殘基構(gòu)成，白色區(qū)域?yàn)榈鞍踪|(zhì)殘基組成的疏水區(qū)域，其他顏色區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)域.圖中白色、紫色、藍(lán)色和黃色分別代表8、14、15和16抑制劑；(b)抑制劑3、9、11和13在外周陰離子活性位點(diǎn)對(duì)接的對(duì)接構(gòu)象在乙酰膽堿酯酶表面的疊加.表面由活性口袋殘基周?chē)?0?范圍內(nèi)的殘基構(gòu)成，白色區(qū)域?yàn)榈鞍踪|(zhì)殘基組成的疏水區(qū)域，其他顏色區(qū)域?yàn)橛H水區(qū)域.圖中白色、紫色、藍(lán)色和黃色分別代表3、9、11和13抑制劑.

研究發(fā)現(xiàn)，二聚體類(lèi)小分子大部分都位于蛋白質(zhì)殘基組成的疏水區(qū)域，尤其是小分子兩端的二聚體環(huán)和苯環(huán)幾乎都位于疏水區(qū)域.但是若小分子6、7號(hào)位的取代基有氧原子出現(xiàn)時(shí)，該區(qū)域有可能位于蛋白質(zhì)殘基組成的親水區(qū)域；由于二聚體小分子母體的內(nèi)酯基負(fù)電作用比較強(qiáng)，極易與周?chē)鞍踪|(zhì)殘基發(fā)生靜電作用產(chǎn)生氫鍵，所以該位置一般位于蛋白質(zhì)殘基組成的親水區(qū)域；抑制劑3號(hào)位取代基上若有氧原子或氮原子出現(xiàn)時(shí)，該部位的氧原子或氮原子有可能與周?chē)鞍踪|(zhì)殘基發(fā)生作用產(chǎn)生氫鍵，所以該位置有時(shí)是位于蛋白質(zhì)殘基組成的親水區(qū)域.

由表1中可以發(fā)現(xiàn)，有很多組二聚體小分子由于對(duì)接能是正值所以在表中沒(méi)有出現(xiàn)，尤其是在Ser203、Glu334和His447組成的正常活性位點(diǎn)對(duì)接時(shí)18組實(shí)驗(yàn)中有12組實(shí)驗(yàn)的對(duì)接能出現(xiàn)正值；而在His287、Tyr72、Tyr441和Glu292組成的外周陰離子活性位點(diǎn)對(duì)接時(shí)只有1組對(duì)接數(shù)據(jù)出現(xiàn)正值.同時(shí)通過(guò)對(duì)結(jié)合能、對(duì)接能和抑制常數(shù)的比較，說(shuō)明該香豆素類(lèi)二聚體抑制劑與乙酰膽堿酯酶作用時(shí)，更容易在外周陰離子活性區(qū)域與乙酰膽堿酯酶發(fā)生作用.在二聚體類(lèi)分子和乙酰膽堿酯酶相互作用時(shí)，它們之間的結(jié)合能和對(duì)接能與二聚體小分子的抑制作用之間并無(wú)良好的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系，即對(duì)接能最低的配體并不是抑制作用最強(qiáng)的，反之亦然.之所以出現(xiàn)這種現(xiàn)象，主要有兩個(gè)方面的原因： (1)在結(jié)合位點(diǎn)相同時(shí)，不同香豆素類(lèi)二聚體小分子的取代基在原子類(lèi)型、原子數(shù)目以及自由度等方面差別較大，這是導(dǎo)致結(jié)合能和對(duì)接能差異較大的一個(gè)關(guān)鍵因素；(2)決定抑制劑抑制效果的因素有很多，除了結(jié)合能以外，受體和配體之間的軌道相互作用、極化作用、疏水性相互作用也是影響抑制劑活性的關(guān)鍵因素.

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，部分抑制劑有兩個(gè)負(fù)電性中心：抑制劑母體的內(nèi)酯區(qū)和6位或7位的芐基區(qū).由于這兩部分負(fù)電作用比較強(qiáng)極易與周?chē)鞍踪|(zhì)發(fā)生靜電作用，從而導(dǎo)致氫鍵的形成.香豆素二聚體類(lèi)小分子主要以?xún)?nèi)酯區(qū)與AChE結(jié)合.這使其有可能成為一種有更好應(yīng)用前景的新型乙酰膽堿酯酶抑制劑.

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