丁香苦苷PLGA納米粒的體外釋放研究

封文靜，管慶霞，張 亮，李夢(mèng)雪，李永吉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040)

丁香苦苷[1](Syringopicroside，SYR)是從丁香葉(Folium syringae)中分離后得到的單體成分，屬于環(huán)烯醚萜苷類化合物，其具有很強(qiáng)的抗菌、抗病毒、保肝利膽等作用，尤其對(duì)乙型肝炎病毒作用顯著.但由于其在體內(nèi)消除較快，半衰期較短等原因，導(dǎo)致其生物利用度并不高.因此本研究采用復(fù)乳化法制得SYR－PLGA納米粒，在此基礎(chǔ)上選取既不需要離心將載藥納米粒與釋放介質(zhì)分離，又能保證納米粒無損失的透析法進(jìn)行SYR－NP的體外釋放研究.

1 試劑與儀器

1.1 藥品與試劑

丁香苦苷對(duì)照品 (黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%);丁香苦苷原料藥(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥劑教研室自制，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%);透析袋(MW:8 000－10 000，美國 Sigma公司);碳酸氫鈉(批號(hào)111009，北京化學(xué)試劑公司);EDTA(批號(hào)20100715，天津市化學(xué)試劑廠);其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

美國Waters公司高效液相色譜儀系統(tǒng):2996Photodiode Array Detector，2695Separations Module，Empower色譜工作站;恒溫水浴振蕩器(哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司);PHS－3C型酸度計(jì)(金壇市榮華儀器制造有限公司);AB265－S電子分析天平(德國梅特勒公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 SYR－PLGA納米粒的制備

取PLGA(LA∶GA=50∶50)加入到二氯甲烷和乙酸乙酯1∶3的混合溶液中，制得質(zhì)量濃度為20 mg/mL的 PLGA溶液，然后將丁香苦苷溶于蒸餾水中，制得10 mg/mL的藥物溶液;其次，按照1∶4的體積比將藥物加入到PLGA溶液中，超聲乳化，制得初乳，然后，將該初乳注入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的poloxamer188水溶液形成初級(jí)復(fù)乳，然后將初級(jí)復(fù)乳按照10倍量體積加入到0.1%poloxamer188的水溶液中，以800 r/min磁力攪拌1～2 h后，將二氯甲烷和乙酸乙酯的混合溶液減壓旋轉(zhuǎn)45～60 min揮發(fā)，形成膠體溶液，經(jīng)過冷凍干燥后，形成SYR－PLGA納米粒.

2.2 丁香苦苷納米粒釋放條件的研究

2.2.1 透析袋的處理

先將透析袋剪成適當(dāng)長度的小段，在大體積的2%(w/V)碳酸氫鈉和1 mmol/L EDTA中(pH=8.0)中將透析袋煮沸15 min，用重蒸水徹底清洗透析袋.再放在1 mmol/L EDTA中(pH=8.0)將之煮沸15 min，冷卻后，用重蒸水徹底沖洗.將透析袋放在重蒸水中.存放于4℃保存?zhèn)溆茫仨毚_保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)，取用透析袋時(shí)必須戴手套，以免造成污染.使用前在透析袋內(nèi)裝滿水然后排出，反復(fù)沖洗，確保透析袋的清潔.

2.2.2 釋放介質(zhì)的選擇

為了模擬體內(nèi)條件，充分考慮血液環(huán)境的pH值在7.35～7.45之間 納米粒進(jìn)入血液循環(huán)中，血液環(huán)境pH值對(duì)其的影響，以及磷酸根離子大量存在于體內(nèi)環(huán)境中可能對(duì)PLGA的降解產(chǎn)生的影響.本實(shí)驗(yàn)選取磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.4)作為釋放介質(zhì)，采用透析法對(duì)SYR納米粒進(jìn)行釋藥研究.

PBS的配制:稱取8 g氯化鈉、0.2 g氫氧化鈉、0.2 g無水磷酸二氫鉀、0.9 g無水磷酸氫二鉀，用重蒸水溶解后定容至1 000 mL.

2.2.3 釋放介質(zhì)穩(wěn)定性考察

稱取適量的丁香苦苷樣品溶于50 mL pH值為7.4磷酸鹽緩沖液中，置于溶出瓶中，37℃水浴，100 r/min恒速振搖，定時(shí)取樣，測定其在0～96 h間的峰面積變化，其 RSD為1.41%(n=3)，表明丁香苦苷在pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液釋放介質(zhì)中的穩(wěn)定性符合要求.

2.3 丁香苦苷納米粒體外釋放實(shí)驗(yàn)

2.3.1 體外釋放分析方法的建立

1)色譜條件

色譜柱:ODS －C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);檢測波長:221 nm;流動(dòng)相:(甲醇∶水)=(50∶50，V/V);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL.配制對(duì)照品溶液、樣品溶液，進(jìn)樣測定.樣品溶液SYR－PLGA保留時(shí)間與對(duì)照品溶液中的一致，輔料對(duì)主藥測定無干擾(見圖1).

圖1 樣品高效液相色譜圖

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥至恒重丁香苦苷對(duì)照品6.12 mg，置100 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度，搖勻得質(zhì)量濃度為0.061 2 mg/mL對(duì)照品溶液.分別吸取對(duì)照品溶液 0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 至10 mL 的量瓶中，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至刻度，分別取10 μL進(jìn)樣分析，以峰面積Y對(duì)質(zhì)量濃度X進(jìn)行回歸，得到回歸方程為Y=0.158 7X+0.769 6(r=0.999 7)，結(jié)果表明丁香苦苷在(1.224～24.448)μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.3.2 體外釋放實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)透析法:一定量丁香苦苷納米粒的凍干粉于適量的重蒸水中溶解，形成復(fù)溶液，分別精密吸取復(fù)溶液和SYR對(duì)照品溶液(均含主藥3 mg).轉(zhuǎn)入經(jīng)處理后的透析袋中，扎緊透析袋兩端，懸浮于50 mL具塞錐形瓶中，錐形瓶中加入磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，將其置于恒溫振蕩器中，以溫度37℃、轉(zhuǎn)速100 r/min持續(xù)振蕩，于不同的時(shí)間 5、10、30、45、60、120、240、360、480、600、720、1 080、1 040、1 800、2 160 min 吸取 2 mL 透析外液，并及時(shí)補(bǔ)充等量同溫的新鮮的釋放介質(zhì)，用HPLC測定釋放介質(zhì)中丁香苦苷的含量，記錄峰面積，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)SYR－NP凍干粉和SYR溶液的累積釋放率，并以累積釋藥百分率(Q)對(duì)時(shí)間(t)作圖，繪制載藥納米粒釋放曲線.SYR－NP和SYR單體的體外釋放數(shù)據(jù)見表1，釋藥曲線見圖2.

在各時(shí)間點(diǎn)的累積釋放百分率(Q)計(jì)算公式為:

其中:W為藥物完全釋放量;V0為初始體積;Vt為各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的體積;Ci為初始質(zhì)量濃度;Ct為各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度.

從表1和圖2的結(jié)果可知，游離藥物在4 h時(shí)體外累積釋放量達(dá)到81.49%，而SYR－NP前4 h時(shí)釋藥較快，30 min時(shí)累積釋放百分率達(dá)16.03%，4 h時(shí)僅釋放了48.03%，之后釋藥曲線漸趨平穩(wěn)，釋放緩慢，在36 h時(shí)累積釋放量達(dá)到88.03%，具有一定的緩釋作用.

2.4 釋藥機(jī)制探討

載藥納米粒的藥物釋放可以通過若干途徑實(shí)現(xiàn)，主要取決于藥物在粒子中所處的部位和載體的性質(zhì).如納米粒表面降解釋藥、整體崩解、骨架擴(kuò)散、水合膨脹、解離擴(kuò)散和解吸附等途徑.藥物既有包封在粒子內(nèi)部的，也有吸附在粒子表面的，還有在粒子淺表層或殼層內(nèi)，因此不同部位的釋藥速度也不同.

目前解釋緩控釋制劑的釋藥動(dòng)力學(xué)方程主要是以Fick’s擴(kuò)散定律為基礎(chǔ)理論而提出的，他們是以一些邊界條件和假設(shè)為基礎(chǔ)，從而得到的Fick’s擴(kuò)散定律的近似解釋，一般有下列常用模型[2].

若藥物釋放符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，則方程為:

若藥物釋放符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型，則方程為:

表1 SYR－NP和SYR累積釋放量的測定結(jié)果

圖2 SYR－NP和SYR溶液的累積釋藥量曲線

處于粒子淺表層或深層部位的藥物釋放受擴(kuò)散控制符合Higuchi方程為其中:Q為累積釋藥量，t為取樣時(shí)間，a1－a3為常數(shù)，b1－b3為釋藥常數(shù).

分別以零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程三種釋藥模型對(duì)SYR－PLGA進(jìn)行體外釋放的的擬合，結(jié)果見表2.

表2 SYR－NPS體外釋放的擬合方程

SYR－NP的體外釋放規(guī)律基本符合Higuchi方程的釋藥模型，擬合的釋藥動(dòng)力學(xué)方程為:Q=0.128 1+0.018 9t1/2(r=0.956 8).

3 討論

3.1 透析方法的篩選

本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)態(tài)透析法[3]考察了丁香苦苷PLGA納米粒的釋藥特性，其基本原理是將載藥納米?；鞈矣谝欢ǖ尼尫沤橘|(zhì)中，將透析袋與釋放介質(zhì)分開，透析袋是一種具有分子截留作用的半透膜藥物經(jīng)透析膜擴(kuò)散至介質(zhì)中，通過測定介質(zhì)中藥物質(zhì)量濃度，獲得累計(jì)釋放規(guī)律的一種方法.該法操作簡單，不破壞釋藥平衡，藥物在釋放介質(zhì)中穩(wěn)定性，溶解性好，不需要定時(shí)完全更換釋放介質(zhì).本實(shí)驗(yàn)選取透析袋截留分子質(zhì)量為8 000～12 000，即分子質(zhì)量小于8 000～12 000的游離藥物可以透過透析袋進(jìn)入釋放介質(zhì)中，而被PLGA包封的藥物因?yàn)榉肿淤|(zhì)量大而被截留在透析袋里，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)，可滿足漏槽條件.

3.2 釋放機(jī)理的探討

藥物從PLGA納米粒中釋放機(jī)理有可能有以下幾個(gè)方面:1)表面降解吸附;2)聚合物表面或整體溶蝕釋放;3)通過納米?？紫稊U(kuò)散;4)通過水溶性聚合物的擴(kuò)散等.不同的釋藥機(jī)理主要取決于乳酸/羥基乙酸共聚物的分子質(zhì)量、納米粒的粒徑大小、藥物含量以及制備工藝等參數(shù)的不同.將丁香苦苷納米粒凍干粉與游離丁香苦苷溶液進(jìn)行對(duì)比釋放實(shí)驗(yàn)，繪制釋放曲線，可以清楚觀察到藥物從丁香苦苷納米粒的釋放分為突釋和緩釋部分[4].釋放曲線可觀察到初期的藥物突釋現(xiàn)象，隨后釋藥曲線趨于平穩(wěn).前期釋藥較快，在最初的0.5 h釋放了藥物的16.30%.藥物的突釋量是藥物溶解度的一個(gè)重要函數(shù)，溶解度越大，載藥的納米粒突釋時(shí)釋藥速度越快，突釋時(shí)間越長;溶解度越小，則突釋量越少，突釋持續(xù)時(shí)間越短[5].盡管納米粒在體外釋藥情況與體內(nèi)存在差別，但體外釋藥仍可以在一定程度上反映體內(nèi)釋藥情況，為預(yù)測SYR－PLGA納米粒的體內(nèi)釋藥情況提供參照，并以此指導(dǎo)處方設(shè)計(jì)以及制備工藝的優(yōu)化.

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