尿素包合法純化α-亞麻酸方法的研究

宮宇嘉，王 鑫，徐麗萍

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院省高校食品科學(xué)與工程重點實驗室，哈爾濱 150076)

α-亞麻酸(α-LNA)為全順式9，12，15-十八碳三烯酸.其作為ω-3系列多不飽和脂肪酸具有顯著的藥理作用和營養(yǎng)價值，在醫(yī)學(xué)界和營養(yǎng)學(xué)界備受關(guān)注[1-2].但人體內(nèi)不能產(chǎn)生α-亞麻酸，只能從外源食物中攝取，在體內(nèi)通過去飽和酶和碳鏈延長酶的催化作用，合成多烯不飽和脂肪酸EPA和DHA.EPA是體內(nèi)三烯前列腺素如PGI3、TXA3和五系白三烯的前體；DHA是大腦、視網(wǎng)膜等神經(jīng)系統(tǒng)膜磷脂的組成成分.這兩種物質(zhì)在降血脂、降血壓、抗血栓、抗癌、抗過敏等方面都可發(fā)揮重要作用.隨著保健食品的興起，α-亞麻酸已成為重要的保健食品基料[3-5].

1 材料與方法

1.1 實驗材料

亞麻籽油，市售.

1.2 主要試劑與儀器

無水乙醇(天津市天博迪化工有限公司)；氫氧化鈉(黑龍江阿城化學(xué)試劑廠)；鹽酸(哈爾濱新達(dá)化工廠)；無水乙醚(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；無水硫酸鈉(天津塘沽鄧中化工廠)；甲醇(哈爾濱新春化工廠)；尿素(北京康普匯維科技有限公司)；DK-98-1型電子恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；ALC-1100.2型電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；便攜式pHS-3C型數(shù)字精密pH計(中國上海儀器廠)；TU-1900 型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；R-205 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；MC 型精密電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；DHG-9203A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)

1.3 實驗方法

1.3.1 混合脂肪酸的制備

在20 g的亞麻油中加入5% NaOH-乙醇溶液，混勻后置60～65 ℃水浴鍋中皂化回流1 h后，在皂化液中加入適量熱水溶解，用少量無水乙醚萃取2次，去除高級脂肪醇、碳?xì)浠衔锏炔辉砘?，下層溶液?0 %鹽酸調(diào)pH值至2～3，置分液漏斗靜置分層，取油層用蒸餾水洗至中性，放入60～65 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥1 h，即得到亞麻油的混合脂肪酸[6].計算混合脂肪酸得率，計算公式(1)如下：

(1)

1.3.2α-亞麻酸定量分析實驗

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將α-亞麻酸轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，分別移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL至25 mL容量瓶中定容，分別在最大吸收波長處測吸光值，繪制α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出線性回歸方程.

1.3.3 尿素包合法提取α-亞麻酸單因素實驗

1) 包合時間對產(chǎn)物的影響

稱取3 g混合脂肪酸，將m混合脂肪酸∶m尿素∶V甲醇按1∶ 3∶ 8的比例加入，攪拌加熱溶解，分別于0 ℃下包合6、9、12、15、18 h，研究包合時間對產(chǎn)物中α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響.

2) 包合溫度對產(chǎn)物的影響

稱取3 g混合脂肪酸，將m∶m尿素∶V甲醇按1∶ 3∶ 8的比例加入，攪拌加熱溶解，分別于-20、-10、0、10、20 ℃下包合12 h，研究包合溫度對產(chǎn)物中α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響.

3)尿素與脂肪酸質(zhì)量比對產(chǎn)物的影響

稱取3 g混合脂肪酸，加入8倍體積的甲醇作為溶劑，按尿素與脂肪酸質(zhì)量比分別為1∶ 1、2∶ 1、3∶ 1、4∶ 1、5∶ 1的比例加入尿素，加熱溶解后，于0 ℃包合12 h，研究尿素與脂肪酸質(zhì)量比對產(chǎn)物中α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響.

4)甲醇體積與質(zhì)量比對產(chǎn)物的影響

稱取3 g混合脂肪酸和3倍質(zhì)量的尿素于甲醇中，甲醇體積分別按V甲醇∶m尿素為4∶ 3、2∶ 1、8∶ 3、10∶ 3、4∶ 1加入，加熱溶解后于0 ℃包合12 h，研究甲醇體積與尿素質(zhì)量比對產(chǎn)物中α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響.

1.3.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化α-亞麻酸提取工藝條件

采用Box-Behnken模型，以包合時間、尿素與脂肪酸質(zhì)量比、甲醇體積與尿素質(zhì)量比三個單因素為影響α-亞麻酸含量的主要考察因子(自變量)，分別以x1、x2、x3表示，并以-1、0、+1分別代表自變量的低、中、高水平，按方程xi=(Xi-x0)/x對自變量進(jìn)行編碼.其中xi為自變量的編碼值，Xi為自變量的真實值，x0為試驗中心點處自變量的真實值，x為自變量的變化步長，因子編碼及水平見表1.并采用多元回歸分析，擬合二次多項式回歸模型的Box- Behnken設(shè)計試驗[7-8]，進(jìn)行結(jié)果分析，得到尿素包合法分離亞麻油中α-亞麻酸的優(yōu)化工藝條件.

1.3.5α-亞麻酸定性分析實驗

將尿素包合法提取物質(zhì)在波長為190～600 nm范圍內(nèi)掃描，比較提取物與標(biāo)準(zhǔn)品圖譜的出峰位置及峰形.

表1Box-Behnken實驗設(shè)計因素水平及編碼

因素 代碼編碼水平編碼未編碼下水平零水平上水平包合時間/hx1X1111213尿素與脂肪酸質(zhì)量比x2X2234甲醇體積與尿素質(zhì)量比x3X322.53

注：編碼值與真實值之間的關(guān)系為：x1=(X1-12)/1，x2=(X2-3)/1，x3=(X3-2.5)/0.5.

2 結(jié)果與討論

2.1 混合脂肪酸的制備結(jié)果與分析

由表2，皂化酸解得到混合脂肪酸產(chǎn)量達(dá)平均值為14.61 g，通過混合脂肪酸得率公式可計算出混合脂肪酸的得率為73.07 %.

表2混合脂肪酸的制備

組別產(chǎn)量/g得率/%114.2473.05215.0975.45315.5077.50均值14.6173.05

2.2 α-亞麻酸定量分析試驗結(jié)果與分析

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果：在300 nm下測定不同質(zhì)量濃度α-亞麻酸標(biāo)樣的吸光值，擬合得回歸方程：y=0.004 7x+0.080 4(R2=0.997 3)，有效線性范圍：50～350 μg/mL，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1.

2.3 尿素包合法提取α-亞麻酸單因素實驗結(jié)果與分析

2.3.1 包合時間對產(chǎn)物的影響結(jié)果與分析

圖1 α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 包合時間對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

由圖2可知，在相同條件下，隨著包合時間的增加，有利于飽和脂肪酸與尿素形成包合物析出，α-亞麻酸質(zhì)量濃度隨著增大.當(dāng)包合時間達(dá)到12 h后，尿素晶體不再析出，α-亞麻酸質(zhì)量濃度隨時間的增加而減小.所以，包合時間控制在12 h為宜.

2.3.2 包合溫度對產(chǎn)物的影響結(jié)果與分析

由圖3可見，在相同條件下，隨著包合溫度的增加，α-亞麻酸質(zhì)量濃度先增加后降低，當(dāng)包合溫度達(dá)到0 ℃的時候達(dá)到最大值，因為包合溫度過高或過低，形成的晶體大且粗糙，使飽和脂肪酸被包合得不牢固，易脫離晶體，因此，包合溫度應(yīng)控制在0 ℃左右[9].

圖3 包合時間對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

2.3.3 尿素與脂肪酸質(zhì)量比對產(chǎn)物的影響結(jié)果與分析

由圖4可知，當(dāng)尿素用量較小時，α-亞麻酸質(zhì)量濃度不高.隨著尿素比例增大，α-亞麻酸質(zhì)量濃度逐漸升高，當(dāng)尿素與脂肪酸質(zhì)量比為3∶ 1時，產(chǎn)物中α-亞麻酸質(zhì)量濃度較高，之后再增加尿素用量，則尿素完全溶解困難、溶解時間加長且α-亞麻酸質(zhì)量濃度降低，因此，尿素與脂肪酸質(zhì)量比為3∶ 1為宜.

圖4 尿素與脂肪酸質(zhì)量比對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

2.3.4 甲醇體積與尿素質(zhì)量比對產(chǎn)物的影響結(jié)果與分析

由圖5可知，隨著甲醇與尿素比值的增大，溶液的飽和度增大，直鏈脂肪酸與尿素形成六面體晶體析出，飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸還未與尿素形成晶體包合物，尿素晶體已經(jīng)析出，因此α-亞麻酸質(zhì)量濃度降低.因此，甲醇體積與尿素質(zhì)量控制在8∶ 3為宜.

圖5 甲醇體積與尿素質(zhì)比對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

2.4 響應(yīng)曲面法優(yōu)化α-亞麻酸提取工藝條件結(jié)果與分析

2.4.1 回歸模型的建立

由于實際試驗過程中，各因素的作用是交互影響的，為了全面考察各個因素的影響，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計了包合時間、尿素與脂肪酸質(zhì)量比、甲醇體積與尿素質(zhì)量比的三因素三水平響應(yīng)面法實驗設(shè)計，其實驗結(jié)果見表3.

利用Design Expert 軟件對表3實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了多元回歸擬合分析，得到α-亞麻酸的質(zhì)量濃度的多元二次回歸方程模型為：Y=178.20-2.25x1+1.00x2+4.75x3-2.00x1x2+2.00x1x3-0.50x2x3-8.85x12-8.85x22-7.85x32

其中：Y為α-亞麻酸質(zhì)量濃度，μg/mL；x1為包合時間，h；x2為尿素與脂肪酸質(zhì)量比；x3為甲醇體積與尿素質(zhì)量比，mL/g.

表3實驗設(shè)計結(jié)果

序號包合時間/h尿素與脂肪酸比甲醇與尿素比/( mL·g-1)α-亞麻酸/(μg·mL-1) 1-1(11.00)1(4.00)0(2.50)163.2121(13.00)10157.4630 (12.00)11(3.00)168.34400(3.00)0179.415000177.896-10-1(2.00)162.227101165.01801-1160.07910-1151.3410-1-1(2.00)0160.48110-1-1154.1112000178.7813-111168.34140-11164.4115000179.09161-10162.0117000178.92

2.4.2 模型及回歸方程系數(shù)的顯著性檢驗

表4響應(yīng)面模型方差分析表

變異源平方和自由度均方和F值P值模型1 288.679 143.1929.65<0.000 1失擬項31.003 10.3314.760.0125純誤差2.804 0.70 總和1 322.4716 R=0.9871,R2=0.9744,R2Adj=0.9416

表5回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

因子回歸系數(shù)自由度標(biāo)準(zhǔn)誤差F值P值模型 178.2010.9833.64<0.0001A-2.2510.788.390.0231B0.8210.781.660.2390C1.0010.7837.380.0005AB-2.0011.103.310.1115AC2.0011.103.310.1115BC-0.5011.100.210.6628A2-8.8511.0768.30<0.0001B2-8.8511.0768.30<0.0001C2-7.8511.0753.730.0002

2.4.3α-亞麻酸質(zhì)量濃度的響應(yīng)面分析

1)包合時間和尿素與脂肪酸質(zhì)量比對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

根據(jù)響應(yīng)面法實驗的結(jié)果，應(yīng)用Design expert軟件得到包合時間和尿素與脂肪酸質(zhì)量比之間的相互作用對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響，如圖6所示.

圖6 包合時間、尿素與脂肪酸質(zhì)量對α-亞麻酸的等高線圖和響應(yīng)曲面

從圖6中包合時間和尿素與脂肪酸質(zhì)量對α-亞麻酸的響應(yīng)面和等高線圖可以得出：當(dāng)包合時間處在最佳值時，隨著尿素與脂肪酸質(zhì)量比的增加，α-亞麻酸質(zhì)量濃度先增大后減小.最佳水平的包合時間為12.80 h，尿素與脂肪酸質(zhì)量比為2.82.

2)包合時間和甲醇體積與尿素質(zhì)量比對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響

根據(jù)響應(yīng)面法實驗的結(jié)果，應(yīng)用Design expert軟件得到包合時間和甲醇體積與尿素質(zhì)量比之間的相互作用對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響，如圖7所示.

圖7 包合時間、甲醇體積與尿素質(zhì)量對α-亞麻酸的等高線圖和響應(yīng)曲面

從圖7中包合時間和甲醇體積與尿素質(zhì)量比對α-亞麻酸的響應(yīng)面和等高線圖可以得出：當(dāng)包合時間處在最佳值時，隨著甲醇體積與尿素質(zhì)量比的增加，α-亞麻酸質(zhì)量濃度先增大后減小.最佳水平的包合時間為12.80 h，甲醇體積與尿素質(zhì)量比為2.44.

3)尿素與脂肪酸質(zhì)量比和甲醇體積與尿素質(zhì)量比對α-亞麻酸質(zhì)量濃度影響

根據(jù)響應(yīng)面法實驗的結(jié)果，應(yīng)用Design expert軟件得到尿素與脂肪酸質(zhì)量比和甲醇體積與尿素質(zhì)量比之間的相互作用對α-亞麻酸質(zhì)量濃度的影響，如圖8所示.

圖8 尿素與脂肪酸質(zhì)量比、甲醇體積與尿素質(zhì)量比對α-亞麻酸的等高線圖和響應(yīng)曲面

從圖8中尿素與脂肪酸質(zhì)量比和甲醇體積與尿素質(zhì)量比對α-亞麻酸的響應(yīng)面和等高線圖可以得出：當(dāng)尿素與脂肪酸質(zhì)量比處在最佳值時，隨著甲醇體積與尿素質(zhì)量比的增加，α-亞麻酸質(zhì)量濃度先增大后減小.最佳水平的尿素質(zhì)量與脂肪酸質(zhì)量比為2.82，甲醇體積與尿素質(zhì)量比為2.44.

2.5 α-亞麻酸定性分析試驗結(jié)果與分析

將尿素包合法提取出的樣品采用雙光束紫外分光光度法檢測，以無水乙醚為空白，在波長為200～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，如圖9得到其最大吸收波長為300 nm，與α-亞麻酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液所測出的最大吸收波長相吻合，即樣品中含有α-亞麻酸.

圖9 α-亞麻酸樣品及標(biāo)品對照紫外光譜圖

3 結(jié) 語

以亞麻籽油為原料，采用尿素包合法分離、提取α-亞麻酸，通過雙光束紫外分光光度計掃描確定α-亞麻酸的最大吸收波長，分別考察包合時間、包合溫度、尿素與脂肪酸質(zhì)量比、甲醇體積與尿素質(zhì)量比對提取α-亞麻酸的影響，通過響應(yīng)曲面優(yōu)化提取α-亞麻酸的最佳工藝條件即包合時間為12.80 h，尿素與脂肪酸質(zhì)量比為2.82，甲醇體積與尿素質(zhì)量比為2.44的數(shù)據(jù)結(jié)果顯著，其條件下α-亞麻酸的質(zhì)量濃度為175.96 μg/mL.采用紫外光譜檢測將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對照，確定提取物富含α-亞麻酸.

參考文獻(xiàn)：

[1] 王麗英, 刁 榮.α-亞麻酸提純技術(shù)的研究[J]. 黑龍江紡織, 2010, 4(3): 1- 3.

[2] 何 楨, 張于軒. 多響應(yīng)試驗設(shè)計的優(yōu)化方法研究[J].工業(yè)工程, 2003, 6(4): 35-38.

[3] MYERS R, MONTGOMERY D, ANDERSON-COOK C. Response surface methodology: process and product optimization using designed experiments [M]. New York: JohnWiley & Sons, 2009.

[4] LIU C G, DESAI K. Preparation and charaterization of selfassembled nanoparticle based on linolenic-acid modified chitosan [J]. J Ocean Univ China, 2005, 4(3): 234- 239.

[5] 金賽紅.α-亞麻酸對炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)作用[J]. 杭州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報, 2002, 23(5-6): 232- 234.

[6] 陶國琴, 李 晨, 周秀琴.α-亞麻酸的保健功效及應(yīng)用[J].食品科學(xué), 2000, 21(12): 140-143.

[7] 趙德義, 徐愛遐, 張博勇. 紫蘇籽油的成分與生理功能的研究[J]. 河南科技大學(xué)學(xué)報: 農(nóng)學(xué)版, 2004, 24 (2): 47- 50.

[8] BEMELMANS W J, BROER J, FESKENS E J,etal. Effect of an increased intake of alpha-linolenic acid and group nutritional education on cardiovacular risk factors: the Mediterranean alpha-linolenic enriched groningen dietary intervention (MARGARIN) study [J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2002, 75(2): 221- 227.

[9] 郭紅英, 馮光柱, 李和平, 等. 脲包法富集高純度紅花油亞油酸甲酯的研究[J]. 糧油加工與食品機械, 2004(12): 41-43.