液質(zhì)聯(lián)用法監(jiān)測(cè)癲癇患兒卡馬西平血藥濃度及結(jié)果分析

曲素欣 陳湛芳

癲癇是生活中最為常見的慢性驚厥性疾病，患病率約為3‰～6‰?；颊咴诎l(fā)病時(shí)，自腦部病灶發(fā)出一種異常的高頻放電，并向病灶周圍正常腦組織擴(kuò)散，激發(fā)腦細(xì)胞廣泛的興奮，從而出現(xiàn)特有的驚厥癥狀，并伴有運(yùn)動(dòng)、感覺、意識(shí)、行為、植物神經(jīng)等方面功能障礙[1-2]。大多數(shù)癲癇患者起病于兒童時(shí)期。近年來由于小兒癲癇基礎(chǔ)與臨床研究的不斷深入及有關(guān)知識(shí)的普及，使大多數(shù)患兒得到了正規(guī)治療，約80%的患兒可獲完全控制，其中大部分能正常生活和學(xué)習(xí)。小兒癲癇根據(jù)病因可分為三類：特發(fā)性（原發(fā)性）癲癇；癥狀性（繼發(fā)性）癲癇；隱源性癲癇。在癲癇發(fā)作的治療中，抗癲癇藥物有特殊重要的意義[3]。抗癲癇藥物可通過兩種方式來消除或減輕癲癇發(fā)作，一是影響中樞神經(jīng)元，以防止或減少他們的病理性過度放電；二是提高正常腦組織的興奮閾，減弱病灶興奮的擴(kuò)散，防止癲癇復(fù)發(fā)[4]。一般將60年代前合成的抗癲癇藥如：苯妥英鈉、卡馬西平、乙琥胺、丙戊酸鈉等稱為老抗癲癇藥，其中苯巴比妥、苯妥英鈉、卡馬西平、丙戊酸鈉是目前廣泛應(yīng)用的一線抗癲癇藥[5]。臨床上使用的大多數(shù)抗癲癇藥物，均需要進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（TDM）。血清抗癲癇藥物的監(jiān)測(cè)方法很多，目前以免疫測(cè)定法、高效液相色譜法（HPLC）[6-7]，氣相色譜與陰離子化質(zhì)譜儀（GC/NICI-MS）聯(lián)用和高效液相色譜與電噴霧離子化雙極質(zhì)譜儀（LC/ESI-MS/MS）聯(lián)用較為常用[8-9]。本文采用卡馬西平作為研究藥物，卡馬西平（酰胺昧嗪，Cabamazepine，CBZ）為一線廣譜抗癲癇藥物，是治療癲癇全身或局部性大發(fā)作的首選藥物[10]。雖然該藥物臨床療效已基本確定且服用者沒有認(rèn)知功能方面的不良反應(yīng)，但由于藥物動(dòng)力學(xué)過程存在明顯的個(gè)體差異，且其治療窗較窄（4～12 mg/L）[11]，臨床容易發(fā)生皮疹、白細(xì)胞減少、肝損害等不良反應(yīng)。因此，監(jiān)測(cè)卡馬西平的血漿濃度并對(duì)其實(shí)施個(gè)體化給藥是臨床安全用藥的保障。今采集168例本院神經(jīng)內(nèi)科門診確診的癲癇患兒，使用高效液相色譜質(zhì)譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）方法進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)，并進(jìn)行結(jié)果分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取經(jīng)本院小兒神經(jīng)內(nèi)科門診確診的癲癇患者168例，其中男102例，女66例，年齡3～14歲，平均8.5歲，平均體重30 kg。所有患者的確診均以病歷、腦電圖及臨床發(fā)作表現(xiàn)、部分患者結(jié)合CT為依據(jù)。癲癇發(fā)作類型參照國(guó)際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）2001年修訂的癲癇發(fā)作分類法：112例全面性發(fā)作，39例為單純局灶性發(fā)作，17例為難以分類的復(fù)雜部分發(fā)作。全部患者一月內(nèi)未服用抗癲癇藥，一周內(nèi)未服用任何其他藥物。經(jīng)體檢，血常規(guī)、血小板、出凝血時(shí)間、肝腎功能、生化檢查及心電圖均正常。實(shí)驗(yàn)前兩周至整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程未用過任何其他藥物，且所有取樣患者均簽署了知情協(xié)議。

1.2 試劑與儀器 卡馬西平對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，甲醇、乙腈均為色譜純，其他試劑均為分析純，水選用超純水。

質(zhì)譜儀為ISQQuantum Discovery MAX質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo Finnigan公司），液相色譜儀為Agilengt 1100型液相色譜儀，配備Agilent EZChrom軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并配有自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器、電噴霧離子源。

1.3 卡馬西平對(duì)照品溶液的配制 精密稱取適量卡馬西平，加甲醇溶液稀釋制成0.1 mg/L的卡馬西平溶液作為標(biāo)準(zhǔn)液儲(chǔ)備使用。

1.4 血樣處理 取血清100 μL置于0.5 mL離心管中，加入甲醇200 μL混勻并渦旋1 min，10000轉(zhuǎn)/min進(jìn)行離心5 min，取上清液60 ℃水浴中N2吹干，用甲醇200 μL溶解混勻并渦旋1 min，10000轉(zhuǎn)/min進(jìn)行離心5 min，然后取離心上清液10 μL進(jìn)樣。

1.5 色譜及質(zhì)譜條件 色譜柱：Waters C18（150 mm×2.1 mm，5 um）；流動(dòng)相：甲醇-0.1%醋酸銨溶液（40∶60），流速為0.3 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

質(zhì)譜條件：ESI掃描范圍100～600 amu；毛細(xì)管電壓：4 kV；鞘氣：30 rab，輔氣：10 rab；毛細(xì)管溫度：350 ℃；采用正離子掃描模式，分別進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描和選擇離子。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn) 見圖1。從圖1可見卡馬西平與內(nèi)源性物質(zhì)分離良好。

圖1 試樣典型色譜

2.2 線性范圍 取空白血清1.0 mL，加入卡馬西平貯備液適量，依次配制成濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0、40.0 mg/L的樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)物濃度X為橫坐標(biāo)，待測(cè)物峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得直線回歸方程為Y=209X+2.09×105（相關(guān)系數(shù)r=0.9967），卡馬西平血藥濃度在位于2.0～40.0 mg/L區(qū)間范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，下限為2.0 mg/L。

2.3 精密度試驗(yàn) 取空白血清，加入卡馬西平貯備液配成血藥濃度為4.0、10.0、20.0 mg/L的血清樣品各5份，于同1 d內(nèi)進(jìn)樣5次測(cè)定，求得日內(nèi)RSD。連續(xù)測(cè)定5 d，求得日間RSD。數(shù)據(jù)見表1。

2.4 回收率試驗(yàn) 取空白血清，加入卡馬西平貯備液配成血藥濃度為4.0、10.0、20.0 mg/L的血清樣品各5份，用隨行的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品濃度，并以測(cè)定值的平均值與配制的理論濃度比較，計(jì)算得相對(duì)回收率。由血清樣品測(cè)得的峰面積與相同濃度卡馬西平對(duì)照品溶液測(cè)得峰面積之比，計(jì)算絕對(duì)回收率。結(jié)果見表1。

表1 卡馬西平的精密度與回收率 %

圖2 卡馬西平質(zhì)譜掃描圖

2.6 患者血藥濃度測(cè)定 168例卡馬西平血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果比較：以卡馬西平血藥濃度正常范圍為4～12 mg/L，將結(jié)果按照不同濃度范圍分為3組，見表2。

168例癲癇患者中有104例的CBZ血藥濃度為4～12 mg/L，其中81例顯效或有效、22例效果不明顯，有效率為77.9%。48例患者的CBZ血藥濃度<4 mg/L，占全部患者28.6%，其中15例患者有效，其余無效；16例患者的CBZ血藥濃度>12 mg/L全部有效，但有4例患者發(fā)生了頭暈、乏力、震顫、疊影等不良反應(yīng)，在調(diào)整給藥劑量后癥狀逐漸減輕，3 d后相應(yīng)癥狀完全消失。

表2 168例次卡馬西平血藥濃度測(cè)定結(jié)果

3 討論

治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）是一門新興邊緣科學(xué)，其目的是通過測(cè)定血中藥物濃度并利用藥代動(dòng)力學(xué)原理和公式，使給藥方案?jìng)€(gè)體化，以提高療效，避免或減少中毒；同時(shí)也為藥物過量、中毒診斷和處理提供理論依據(jù)。癲癇藥物TDM是臨床醫(yī)學(xué)上最先進(jìn)最活躍的也是最有成效的領(lǐng)域[12]。在此之前，治療是經(jīng)驗(yàn)性的，而開展以后，醫(yī)生能積極主動(dòng)地以藥代動(dòng)力學(xué)的觀點(diǎn)去制定和調(diào)整用藥方案，以提高抗癲癇藥物治療的安全性，避免對(duì)機(jī)體造成危害。

卡馬西平血藥濃度在大于12 mg/L時(shí)，其治療有效率大大提高，這充分說明了治療效果不佳時(shí)，患者應(yīng)重視血藥濃度監(jiān)測(cè)[13]。此外，在結(jié)果高于治療濃度范圍的高限時(shí)，亦有服用丙戊酸鈉患者效果不好，提示醫(yī)師應(yīng)該換藥或聯(lián)合用藥。而卡馬西平不出現(xiàn)此情況，是否與例數(shù)太少有關(guān)，值得進(jìn)一步探討。但由于卡馬西平較大的毒性，患者應(yīng)在醫(yī)師的指導(dǎo)下，在控制病情的前提下，降低血藥濃度，以減少不良反應(yīng)。

在臨床對(duì)癲癇患者進(jìn)行聯(lián)合用藥時(shí)，由于藥物的相互作用，時(shí)常出現(xiàn)干擾藥物監(jiān)測(cè)結(jié)果及療效的判斷。因此在進(jìn)行聯(lián)合用藥應(yīng)增加監(jiān)測(cè)次數(shù)，以防劑量不足所致無效或劑量過剩致中毒。本研究168例患者中有104例血藥濃度位于4～12 mg/L的正常范圍，約占60.5%?？傮w來看雖然此數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道略有差異[14]，但造成這種差異的原因可能與卡馬西平的個(gè)體用藥差異有關(guān)。劑量與穩(wěn)態(tài)血藥濃度之間的關(guān)系存在明顯的個(gè)體差異。臨床醫(yī)師并不十分清楚每位患者治療前所需要維持的最低有效血藥濃度，所以進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)可以幫助患者找出最佳控制濃度，以達(dá)到最佳療效并縮小不良反應(yīng)至最小[15]。

本組中所采用的LC-MS液譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有專屬性強(qiáng)、靈敏度和準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，將傳統(tǒng)上測(cè)定藥物制劑含量只限于大劑量、高濃度的視野轉(zhuǎn)移至小劑量、低濃度、高精度的檢測(cè)方向上來，用一種更為精確的質(zhì)量分析方法來服務(wù)于藥物制劑含量的測(cè)定。該方法的定量下限已達(dá)到2.0 mg/L，可較為有效地滿足臨床測(cè)定血藥濃度的要求。

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