血漿let-7c在煙霧病中的表達(dá)變化及意義

趙紹云 龔 哲 張 靜 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕軍放 賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

血漿let-7c在煙霧病中的表達(dá)變化及意義

趙紹云 龔 哲 張 靜 徐小隔 王天舒 焦淑杰 何 霞 滕軍放 賈延劼

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450052

目的 探討煙霧病(MMD)患者血清let-7c的表達(dá)變化及意義。方法 實(shí)驗(yàn)組選擇MMD患者29例，對(duì)照組選擇正常健康人群29例，腦出血15例，大面積腦梗死20例，非大面積腦梗死18例，神經(jīng)免疫性疾病31例。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組血清let-7c表達(dá)水平。結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR表明，MMD患者血清let-7c的表達(dá)水平較對(duì)照組、非大面積腦梗死、大面積腦梗死、腦出血、神經(jīng)免疫性疾病患者增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 煙霧病患者中血清let-7c表達(dá)上調(diào)，為其診斷提供潛在的新生物學(xué)標(biāo)記物。

煙霧??；let-7c；PCR

煙霧病(Moyamoya disease，MMD)于1957年Takeuchi和Shimizui首次描述，是一種原因不明表現(xiàn)為床突上段頸內(nèi)動(dòng)脈及其Willis環(huán)的主要分支進(jìn)行性嚴(yán)重狹窄直至閉塞為主要特征的特發(fā)性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。流行病學(xué)顯示，本病亞洲多發(fā)，6%～10%患者有一定家族史，10歲以下小兒和40歲左右成人是其兩個(gè)發(fā)病高峰。

微小RNA(miRNA)是一種大小為22 nt左右的非編碼單鏈小分子，具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，是調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵因子[1]，廣泛參與了機(jī)體的各種調(diào)節(jié)途徑。已在多種疾病中相繼發(fā)現(xiàn)miRNA可能作為潛在的生物標(biāo)記物[2-4]，用于臨床診斷和疾病預(yù)后判斷等方面。let-7家族是最早發(fā)現(xiàn)的miRNA 之一，有13位成員，其中l(wèi)et-7c在腫瘤、炎癥等發(fā)生中有一定作用[5]，可能成為某些疾病的潛在生物標(biāo)志物。本研究初步探索let-7c在煙霧病患者血清中表達(dá)變化及其意義[6]。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2013-09—2014-07就診于鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診及住院治療患者。按照1997年修訂的Moyamoya病診斷標(biāo)準(zhǔn)，選取煙霧病患者29例為實(shí)驗(yàn)組，男15例，女14例，平均年齡(45±13.74)歲；其中腦出血5例，非大面積腦梗死10例，大面積腦梗死5例，無腦梗死或腦出血9例，無感染、腫瘤、自身免疫性疾病等并發(fā)癥。對(duì)照組29例，男15例，女14例，平均年齡(45±4.81)歲；無腦血管疾病，感染、腫瘤、自身免疫性疾病等并發(fā)癥；腦出血患者15例(腦出血組)，男8例，女7例，平均年齡(48±9.90)歲；無感染、腫瘤、自身免疫性疾病。大面積腦梗死患者20例(大面積腦梗死組)，男12例，女8例，平均年齡(50±5.22)歲；非大面積腦梗死患者18例(非大面積腦梗死組)，男9例，女9例，平均年齡(48±10.70)歲；神經(jīng)免疫性疾病31例(神經(jīng)免疫性疾病組)，男16例，女15例，平均年齡(43±8.37)歲；其中多發(fā)性硬化10例，視神經(jīng)脊髓炎5例，多發(fā)性肌炎8例，重癥肌無力8例。各組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，具有可比性。所有患者均通過病史、影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查等確診。分別收集入組患者及健康正常人血液標(biāo)本。該實(shí)驗(yàn)由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得所有受試者或其委托人知情同意。

1.2 方法

1.2.1 取材： 用普通生化管抽取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組外周靜脈血2 mL，于4℃，RCF(1 000～1 200)×g條件下離心10 min，取上層血清，分裝在已滅菌的EP管內(nèi)，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 提取血清中的miRNA：按miRNA Purification Kit miRNA 提取試劑盒(康為世紀(jì) )說明書手工提取血清miRNAs。

1.2.3 通過實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)血清中的miRNA進(jìn)行定量：按照Reverse Transcription System( Promega 公司) 說明書，將microRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,其反應(yīng)的總體積為20 μL。按照GoTaq qPCR Master Mix 熒光定量檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，以5 s為內(nèi)參。Let-7c及內(nèi)參特異性的引物序列參照miRBase database，由廣州銳博生物公司合成。每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，每例樣本重復(fù)檢測(cè)3次。應(yīng)用LightCycler1.5定量PCR儀(Roche公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。檢測(cè)miRNA的相對(duì)表達(dá)定量時(shí)，采用2-△△法進(jìn)行結(jié)果分析，將各組的相對(duì)表達(dá)定量值(relative quantity，RQ)進(jìn)行比較，RQ=2-△△，△△Ct=待測(cè)標(biāo)本的△Ct-對(duì)照樣本△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)或Bonferroni法，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果及實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的血清let-7c相對(duì)表達(dá)量 各實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組人群血漿中l(wèi)et-7 c及5 s的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線均呈“S”型；PCR產(chǎn)物溶解曲線均為單峰，說明擴(kuò)增的目的基因特異性好且結(jié)果可靠。

表1 各組血清let-7 c表達(dá)水平

2.2 各組血清let-7c表達(dá)水平 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組、大面積腦梗死組、非大面積腦梗死組、神經(jīng)免疫性疾病組、正常健康人群組的let-7 c的相對(duì)表達(dá)量，見表1。結(jié)果顯示，MMD患者血清let-7 c的表達(dá)水平較正常健康人群、大面積腦梗死、神經(jīng)免疫性疾病升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清let-7 c在非大面積腦梗死、腦出血患者中的表達(dá)水平較MMD患者降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但較正常健康人群升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

煙霧病(MMD)患者常以腦出血或缺血起病。成人煙霧病以腦出血為主要損害表現(xiàn)，多因?yàn)檠茇?fù)荷加重、異常新生血管網(wǎng)血管壁壓力過高破裂、微小動(dòng)脈瘤破裂等引起。而當(dāng)顱內(nèi)大血管狹窄引起血流供應(yīng)減少，當(dāng)代償擴(kuò)張及側(cè)支循環(huán)不能滿足腦組織需要時(shí)，可發(fā)生腦梗死。

現(xiàn)煙霧病診斷主要依靠DSA、MRA、CTA等影像學(xué)檢查資料，尚無其他相關(guān)特異實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。近年來血漿/血清中的miRNA在疾病中的作用與診斷價(jià)值引起人們的關(guān)注[7]，其性質(zhì)非常穩(wěn)定[8]，即使在100℃煮10 min或室溫放置數(shù)小時(shí)、-80℃和室溫下反復(fù)凍融，血漿表達(dá)水平基本不變。MMD病因不明，危險(xiǎn)因素可能包括遺傳因素、炎癥、感染、自身免疫反應(yīng)等，本研究通過檢測(cè)不同人群的血清let-7c的表達(dá)水平，可發(fā)現(xiàn)較腦出血、大面積腦梗死、非大面積腦梗死、神經(jīng)免疫性疾病及正常健康人，MMD患者表達(dá)水平升高，提示血清let-7c可能為該疾病診斷的潛在新生物學(xué)標(biāo)記物。

Let-7c嵌于長非編碼基因LINC00478，作用于許多靶基因，如TRIB2、BUB1, RAS、MYC、RTCD1、TGFBR1等[9]。C-MYC是一種多功能、核內(nèi)磷酸化蛋白，參與了細(xì)胞周期進(jìn)程、凋亡等過程[10]。Ras蛋白控制了參與細(xì)胞質(zhì)骨架整合、細(xì)胞增殖、分化、黏附、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[11]。MED28可能參與與平滑肌細(xì)胞分化調(diào)控過程,也能通過作用于表皮生長因子(EGF)影響腫瘤遷移[12-13]。RTCD1通過調(diào)控rRNA合成等參與細(xì)胞增長、細(xì)胞大小的調(diào)節(jié)。多種研究表明，let-7c通過作用于原癌基因，產(chǎn)生抑癌作用，已提出的作用位點(diǎn)有Ras/NF-κB、TRIB2[14]、Bcl-xl 、IGF1R[15-16]、ITGB3 和 MAP4K3[17]等。Let-7c能直接抑制Bcl-xl表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[18]。IGF1R、MAP4K3、Bcl-xl與mTOR信號(hào)通路相關(guān)，mTOR信號(hào)通路對(duì)血管生成、細(xì)胞遷移和血管新生與再生發(fā)揮一定作用。推測(cè)let-7c可能通過血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞調(diào)節(jié)與煙霧病相關(guān)的重要基因影響MMD患者血管新生與重建。有研究稱，miRNAs被運(yùn)輸?shù)轿⑴?，并致使受體細(xì)胞基因沉默，微泡中的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤衍生的RNA可被吸收入腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HBMVEC)并發(fā)揮作用，let-7c也可能通過該方式調(diào)節(jié)煙霧病相關(guān)基因。

本研究表明煙霧病患者中血清let-7c表達(dá)上調(diào)，可能為該疾病診斷提供潛在的新生物學(xué)標(biāo)記物。但let-7c表達(dá)水平與MMD發(fā)生發(fā)展之間是否可能有進(jìn)一步的深層次關(guān)系，仍需進(jìn)一步深入研究。

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(收稿2014-05-20)

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1673-5110(2014)23-0028-03