季銨鹽類農(nóng)藥殘留檢測前處理研究

張慶慶，王燕燕，孟品佳

（1.中國人民公安大學(xué)刑事科學(xué)技術(shù)系，北京100038；2.北京市公安局法醫(yī)鑒定中心，北京100192）

0 引言

常見的季銨鹽類農(nóng)藥有百草枯（Paraquat，PQ）、敵草快（Diquat，DQ）、燕麥枯（Difenzoquat，DF）及植物生長調(diào)節(jié)劑矮壯素（Chlormequat，CQ）和甲哌啶（Mepiquat，MQ），均屬強堿性極性陽離子有機化合物（結(jié)構(gòu)見圖1），易溶于水、揮發(fā)性低、在酸性和中性條件下穩(wěn)定.其中，百草枯在pH＞12時水解，敵草快在pH＞9時緩慢降解，燕麥枯、甲哌啶和矮壯素具有不易生物降解和水解的特性（理化性質(zhì)見表1［1］），液液萃?。↙LE）方式較難實現(xiàn)對痕量殘留的分離、凈化和富集，固相萃取作為一種有效的前處理技術(shù)近年來廣泛的應(yīng)用于季銨鹽檢測中.

圖1 季銨鹽類農(nóng)藥分子結(jié)構(gòu)式

表1 季銨鹽農(nóng)藥的理化性質(zhì)

1 固相萃取吸附劑

目前用于季銨鹽類農(nóng)藥檢測的固相萃取吸附劑主要有以下3類：

1.1 鍵合硅膠吸附劑 鍵合硅膠上未封端硅羥基在pH＞2時帶負電荷，與極性組分間存在偶極-偶極作用、離子相互作用及氫鍵作用，易與季銨鹽類化合物發(fā)生不可逆吸附作用.Vidal［2］、Ibá?ez［3］和Gill［4］使用硅膠和C18柱時，通過添加十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）來減少因吸附而造成的損失.王瑞花［5］稍作改進后使尿液、血液、肝臟樣品中百草枯的提取率增加至83%.劉菲［6］用堿性CTAB處理C18柱，并用堿性己烷磺酸鈉離子試劑富集蔬菜中的百草枯，檢出限達10ng／mL.成美容［7］處理茶葉這類含有多種茶多酚和生物堿等干擾成分的檢材時，在弱堿性溶液中用CTAB修飾C18，堿性環(huán)境避免了生物堿形成陽離子與百草枯競爭吸附點.由于鍵合硅膠類吸附劑的穩(wěn)定性受到樣品pH值的限制，正逐漸被其它更耐酸堿的吸附劑所替代.

1.2 有機聚合物吸附劑 相較于硅膠基質(zhì)，聚合物樹脂型吸附劑更耐酸堿，具有不受無機鹽等低分子化合物的影響；沒有活性羥基的次級吸附作用；不存在上樣前柱子干涸而產(chǎn)生對柱效的影響；具有比鍵和硅膠更高的保留容量等優(yōu)點.季銨鹽類化合物性質(zhì)適用于離子交換模式萃取，常見的樹脂型離子交換柱是以聚苯乙烯-二乙烯基苯（PS-DVB）為基質(zhì)的萃取柱，Castro［8］比較了Hysphere-C8EC（辛基硅膠）、PLRP-S（聚合物）、Hysphere-Resin GP（聚苯乙烯）、Hysphere-Resin SH（聚苯乙烯和二乙烯基苯）、Hysphere-C18HD EC（鍵合十八烷基硅膠）等固相柱，結(jié)果顯示矮壯素、甲哌啶和敵草快在使用C8和C18柱時回收率都很低，敵草快在使用C18柱時幾乎沒有回收，而使用樹脂型柱時均能取得較好的回收率.張婷［9］用國產(chǎn)732陽離子樹脂提取尿液和血樣中的百草枯也取得了不錯的結(jié)果.而近年來出現(xiàn)了由親脂性二乙烯基苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體共聚的親水-親脂兩親平衡型吸附劑，如Strata-X-CW［10］和Oasis WCX［11］，是以聚合物為基質(zhì)的弱陽離子交換和反相雙重機理混合型萃取材料，這種水可浸潤型吸附劑對極性和非極性化合物均有保留能力，能同時保留酸性、中性、堿性分析物.Yong［11］用Oasis WCX柱提取河水中的百草枯和敵草快，相對回收率達到95%～109%，接著李紅梅［12］在Yong的基礎(chǔ)上引入離子液體優(yōu)化了實驗.

1.3 碳基吸附劑等 碳基吸附劑（活性炭，石墨化炭黑，多孔石墨化碳，碳納米管）對極性和非極性樣品中的極性和非極性有機化合物均有較高的吸附力，有較大的極性適用范圍，但會對某些化合物產(chǎn)生不可逆吸附.Nu′n?ez［13］用多孔石墨化炭黑富集水中三種季銨鹽除草劑，燕麥枯的回收率是80%，而百草枯和敵草快的回收率僅為40%，可能是與吸附劑間發(fā)生了不可逆吸附的原因.趙永信［14］比較SCX（強陽離子交換型反相鍵合硅膠）、MCX（混合陽離子型聚合物）、硅膠、CARB（碳基吸附劑）、CARB／NH2（碳／氨丙基）、CARB／PSA（碳／乙二胺-N-丙基）等萃取柱，發(fā)現(xiàn)這些萃取柱對季銨鹽的吸附力均很強，純有機溶劑難洗脫，水溶液雖洗脫容易，但不利于后續(xù)衍生化氣相色譜分析.后采用國產(chǎn)中性氧化鋁萃取柱時，發(fā)現(xiàn)凈化液干擾少，回收率85%以上.多壁碳納米管是一種新型的碳納米材料，Zhou［15］用N摻雜TiO2納米管富集水樣中的百草枯和敵草快，檢出限分別為1.95μg／L，2.59μg／L，表明碳納米管也具有較好的富集能力，但其在固相萃取的應(yīng)用還在研究階段.

2 待測物洗脫

水相中鍵合硅膠表面硅羥基的次級作用較強，須調(diào)節(jié)pH值來削弱次級吸附（低pH值可中和硅羥基），如硅膠類用酸性甲醇溶液［2］洗脫；氧化鋁僅用甲醇［14］就可以洗脫；石墨化炭黑和樹脂等用甲醇、乙腈、三氟乙酸、水等混合溶液［11，13］來洗脫.在洗脫液中加入反離子，如氨改性劑（二乙胺或三乙胺等）與待測化合物的氨基競爭表面硅羥基，以減弱待測物與吸附劑的次級吸附，以便待測物盡快洗脫.如以磷酸為基質(zhì)的二乙胺［6］，甲醇-甲酸銨［16］等洗脫液.季銨鹽類農(nóng)藥屬于陽離子化合物，適宜選用弱陽離子交換柱.萃取時應(yīng)注意樣品pH值須讓目標(biāo)化合物和吸附劑帶相反的電荷，而水相中季銨鹽在pH值1～14范圍內(nèi)幾乎都以離子形式存在，因此洗脫時應(yīng)主要考慮柱上鍵合離子的狀態(tài).弱陽離子交換柱上鍵合的羧基官能團pKa值約在4.8左右，當(dāng)調(diào)節(jié)樣品pH值大其2個單位時，吸附劑表面帶負電荷，能吸附分離季銨鹽類陽離子.清洗時注意使用同樣pH值的緩沖液，而洗脫時用低于羧基弱陽離子pKa值至少2個單位值的混合溶劑，使吸附劑的羧基轉(zhuǎn)變?yōu)橹行韵疵摚?0-11］.

3 固相萃取應(yīng)用

3.1 液體樣品 環(huán)境水樣［2，11，13，15］固體顆粒含量高時需過濾［2，15］.飲用水中有害物質(zhì)濃度很低，大量通過萃取柱時會使已預(yù)處理好的柱表面伸展開的碳鏈萎縮，萃取效能降低，可考慮加1%～5%的水溶性甲醇或異丙醇等有機溶劑［17］改善.有時考慮不過濾樣品，讓樣品直接通過萃取裝置，洗脫時，讓溶劑通過吸附劑上的顆粒以提高回收率.酒精含量高時，需用水或緩沖溶液稀釋至酒精含量小于10%.果汁一般離心取上層溶液即可，粘性大的可能需用水或適當(dāng)?shù)膒H值緩沖溶液稀釋［16］.脂肪和油類可用正己烷、二氯甲烷等非極性有機溶劑溶解后處理［18］.現(xiàn)將國內(nèi)外對于水樣中季銨鹽的固相萃取法歸結(jié)為表2.

表2 水樣中季銨鹽類農(nóng)藥固相萃取方法

續(xù)表2

3.2 生物樣品 血清與血漿常用緩沖溶液稀釋后離心，或用乙腈［19-21］、甲醇或丙酮沉淀蛋白質(zhì)，離心后移取上層清液，用水或緩沖溶液稀釋后萃取.也可用酸或無機鹽，如甲酸、高氯酸［22］、三氯乙酸（TCA）［23］、偏磷酸和硫酸銨等脫蛋白.對生物組織的酸分解和脫蛋白，常用硫酸［24］、高氯酸［25］等.此外，酶水解來釋放化合物或藥物［5］效果會更好，但操作繁瑣.尿液含有大量鹽，有時須用水或者緩沖溶液稀釋至少一倍.現(xiàn)將國內(nèi)外對于生物樣本中季銨鹽農(nóng)藥固相萃取法歸結(jié)為表3.

表3 生物樣品中季銨鹽類農(nóng)藥固相萃取方法

3.3 土壤、植物等樣品 蔬果及農(nóng)產(chǎn)品研磨后加極性溶劑，如乙腈［26］、甲醇-甲酸（鹽酸）［6-7，27］、甲醇-乙腈［14］、甲醇-甲酸銨［16］和甲醇-乙酸銨［28］等均質(zhì)化，離心或過濾除去沉淀固體后調(diào)節(jié)pH值萃取.傳統(tǒng)的索氏萃取法效率高但耗時長，其他的技術(shù)如超聲波萃?。?8］、加速溶劑萃?。?9］、微波輔助萃?。?0］、超臨界萃?。?8］等能通過外加能量提高萃取效能，萃取成分也比常規(guī)的復(fù)雜，需進一步萃取凈化.某些專業(yè)的萃取儀器萃取效能雖高但價格昂貴難以普及，如Marchese［29］使用Dionex ASE200加速溶劑自動化連續(xù)萃取系統(tǒng)，檢測面粉和嬰兒食品中的甲哌啶和矮壯素，檢測限能達到納克級.現(xiàn)將國內(nèi)外對果蔬等食品中季銨鹽的固相萃取法歸結(jié)為表4.

表4 果蔬等食品樣品中的季銨鹽類農(nóng)藥固相萃取方法

4 結(jié)論與展望

固相萃取法操作簡便、快速、回收率高，重現(xiàn)性好，適合提取微量樣品.目前，固相萃取材料側(cè)重于開發(fā)混合型吸附劑，能綜合運用氫鍵、極性、非極性以及離子相互作用等多種作用力，適用范圍廣，通用性更強，能用于各種化合物的萃取分離.近來常用于季銨鹽類的固相萃取柱主要包括弱陽離子交換柱（如Oasis WCX柱、Strata-X-CW柱等）、一般型萃取柱（C18柱、氰基柱等）以及碳納米管等.而以上這些都存在選擇性不夠強，對提純液凈化不夠完全等問題.農(nóng)藥殘留痕量物質(zhì)分析中，因基質(zhì)的多樣性、待測組分含量低，選擇性分離分析成為前處理的研究熱點.因此固相萃取研發(fā)的一個重要方向就是開發(fā)具有高度特異性的選擇型吸附劑，如免疫萃取吸附劑和分子印跡聚合物吸附劑.這些吸附劑都具有特異性和選擇性的優(yōu)勢，萃取、濃縮、分離可一步完成，能有效地降低基質(zhì)的干擾，高度選擇性的分離分析實際樣品中殘留的農(nóng)藥分子.但免疫萃取吸附劑目前存在抗體的種類不多，尤其是小分子化合物的抗體制備技術(shù)難度較大，制作成本高，難以得到推廣.分子印跡聚合物吸附劑是近年來出現(xiàn)的另一種新型的選擇性萃取劑，目前仍處于實驗室的研制階段，這兩種選擇性吸附劑在季銨鹽類農(nóng)藥檢測方面的研究與應(yīng)用不多，本文中不做論述.由此可見，不斷改進的固相萃取新材料將進一步的優(yōu)化實驗方法，具備高度特異性的選擇性吸附劑未來具有非常廣闊的應(yīng)用前景，固相萃取仍將是未來幾年前處理的主流方法.

［1］PicóY，F(xiàn)ont G，MoltóJ C，et al.Solid-phase extraction of quaternary ammonium herbicides［J］.J Chromatogr A，2000，885（1／2）：251-271.

［2］Vidal J L，Vega A B，López F J，et al.Application of internal quality control to the analysis of quaternary ammonium compounds in surface and groundwater from Andalusia（Spain）by liquid chromatography with mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1050（2）：179-184.

［3］Ibá?ez M，PicóY，Ma?es J.Improving the solid-phase extraction of“quat”pesticides from water samples Removal of interferences［J］.J Chromatogr A，1998，823（1／2）：137-146.

［4］Gill R，Qua S C，Moffat A C.High-performance liquid chromatography of paraquat and diquat in urine with rapid sample preparation involving ion-pair extraction on disposable cartridges of octadecyl-silica［J］.J Chromatogr A，1983，255（1）：483-490.

［5］王瑞花，蘇少明，秦光明，等.離子對SPE-HPLC法檢測生物檢材中的百草枯［J］.法醫(yī)學(xué)雜志，2005，21（2）：121-123.

［6］劉菲，勉麗娜，張婧，等.高效液相色譜法測定植物中的百草枯［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009，19（6）：1248-1249.

［7］成美容，王園朝，肖亮.毛細管電泳-間接電化學(xué)發(fā)光法對茶葉中百草枯農(nóng)藥殘留的檢測［J］.分析測試學(xué)報，2009，28（12）：1444-1447.

［8］Castro R，Moyano E，Galceran M T.Determination of quaternary ammonium pesticides by liquid chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2001，914（1／2）：111-121.

［9］張婷，譚家錳，齊寶坤，等.氣相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法分析尿和血中除草劑百草枯［J］.中國法醫(yī)學(xué)雜志，2009，24（3）：161-163.

［10］Whitehead R D，Montesano M A，Jayatilaka N K，et al.Method for measurement of the quaternary amine compounds

paraquat and diquat in human urine using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］.J Chromatogr B，2010，878（27）：2548-2553.

［11］Yong M，Jenklns K .河水中的百草枯和敵草快的SPE和LC-MS分析方法［J］.環(huán)境化學(xué)，2004，23（6）：722-723.

［12］李紅梅，孫守威，史謝飛.高效安全的敵草快和百草枯液相色譜分離分析技術(shù)［J］.分析化學(xué)研究簡報，2007，35（10）：1499-1502.

［13］Nú?ez O，Moyano E，Galceran M T.Solid-phase extraction and sample stacking-capillary electrophoresis for the

determination of quaternary ammonium herbicides in drinking water［J］.J Chromatogr A，2002，946（1／2）：275-282.

［14］趙永信，宋國良，張晶，等.氣相色譜／質(zhì)譜法測定糧食中矮壯素殘留［J］.中國衛(wèi)生檢驗雜志，2008，18（6）：1064-1066.

［15］Zhou Q X ，Mao J L，Xiao J P，et al.Determination of paraquat and diquat preconcentrated with N doped TiO2

nanotubes solid phase extraction cartridge prior to capillary electrophoresis［J］.Anal Methods，2010，2：1063-1068.

［16］Esparza X，Moyano E，Galceran M T .Analysis of chlormequat and mepiquat by hydrophilic interaction

chromatography coupled to tandem mass spectrometry in food samples［J］.J Chromatogr A，2009，1216（20）：4402-4406.

［17］陳小華，汪群杰.固相萃取技術(shù)與應(yīng)用［M］.北京：科學(xué)出版社，2010.136.

［18］Zougagh M，Bouabdallah M，Salghi R，et al.Supercritical fluid extraction as an on line clean up technique for rapid amperometric screening and alternative liquid chromatography for confirmation of paraquat and diquat in olive oil samples［J］.J Chromatogr A，2008，1204（1）：56-61.

［19］邱葵，吳華，張征，等.LC-MS／MS測定患者全血中百草枯的濃度［J］.中國藥學(xué)雜志，2009，44（16）：1259-1261.

［20］Zou Y，Shi Y，Bai Y，et al.An improved approach for extraction and high-performance liquid chromatography analysis of paraquat in human plasma［J］.J Chromatogr B，2011 ，879（20）：1809-1812.

［21］趙森，張云峰，王炯，等.甲哌啶在大鼠體內(nèi)的分布研究［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2013，449（2）：147-150.

［22］陳璐，鄒靜，肖洪濤，等.高效液相色譜法測定人血清中百草枯濃度［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2010，30（24）：2091-2094.

［23］Fuke C，Arao T，Morinaga Y，et al.Analysis of paraquat，diquat and two diquat metabolites in biological materials by high-performance liquid chromatography［J］.Leg Med，2002，4（3）：156-163.

［24］Kuo T L.Determination of paraquat in tissue using ion-pair chromatography in conjunction with spectrophotometry［J］.Forensic Sci Int，1987，33（3）：177-185.

［25］Nagata T，Kudo K，Kimura K，et al.Simultaneous determination of paraquat and diquat in human tissues by highperformance liquid chromatography［J］.J Chromatogr B，1993，617（1）：119-123.

［26］張曦，金芬，錢永忠，等.高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜法測定櫻桃番茄中的四種季銨鹽農(nóng)藥［J］.食品工業(yè)科技，2011，32（6）：394-397.

［27］Kolberg D I，Mack D，Anastassiades M，et al.Development and independent laboratory validation of a simple method for the determination of paraquat and diquat in potato，cereals and pulses［J］.Anal Bioanal Chem，2012，404（8）：2465-2474.

［28］Li W X，Chen M，Chen W T，et al.Determination of mepiquat chloride in cotton crops and soil and its dissipation rates［J］.Ecotoxicol Environ Saf，2012，85：137-143.

［29］Marchese S，Perret D，Bafile E，et al.Pressurized liquid extraction coupled with LC-ESI-MS-MS for the

determination of herbicides chlormequat and mepiquat in flours［J］.Chromatographia，2009，70（5／6）：761-767.

［30］Pateiro-Moure M，Martínez-Carballo E，Arias-Estévez M，et al.Determination of quaternary ammonium herbicides in soils：comparison of digestion，shaking and microwave-assisted extractions［J］.J Chromatogr A，2008，1196-1197：110-116.