UPLC－MS／MS法同時測定川黃口服液中的5種有效成分

岑衛(wèi)健，朱平川，范曉蘇，莫琪紅

（1.亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（廣西大學(xué)），廣西 南寧530004；

2.廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧530004；3.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧530004）

0 引言

川黃口服液是由丹參、制何首烏、黨參、黃芪、枸杞子、杜仲、當(dāng)歸、川芎、蛤蚧、蘄蛇、海龍12味中藥材研制而成的復(fù)方口服液，具有益氣養(yǎng)血、滋補(bǔ)肝腎，活血化瘀.能改善氣血兩虛，肝腎不足所致的神疲乏力，頭暈?zāi)垦?，腰膝酸軟等癥.對免疫功能低下、放化療后白細(xì)胞減少及高脂血癥等有輔助治療作用［1］.已有文獻(xiàn)報道采用毛細(xì)管電泳法［2］、高效液相色譜法［3-5］、反相液相色譜法［6］測定香丹注射液中原兒茶醛，丹參中原兒茶醛，當(dāng)歸補(bǔ)血湯中黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ，活血安痛酒中隱丹參酮、丹參酮ⅡA的含量.在川黃口服液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，只有性狀鑒別檢查和正丁醇、原兒茶醛的定量檢查方法，目前尚少見有文獻(xiàn)報道對川黃口服液中其他有效成分的測定.

利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測法（UPLC-MS／MS），可以較好地分離分析中藥口服液中的復(fù)雜成分［7-8］.本文中運(yùn)用UPLC-MS／MS建立了同時測定益氣養(yǎng)血口服液中的原兒茶醛、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA 5種有效成分含量的分析方法，該方法具有簡單、快速、準(zhǔn)確、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)，可以用于實(shí)際的樣品分析，為藥物質(zhì)量控制提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)6460（美國Agilent公司），數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），電子天平（德國Sartorius），超純水儀（美國Millipore公司）.原兒茶醛對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），黃芪甲苷對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），黃芪皂苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄅ枺褐袊幤飞镏破窓z定所），隱丹參酮對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），丹參酮ⅡA對照品（批號：中國藥品生物制品檢定所），甲醇、乙腈（色譜純，Themro Fisher公司），甲酸（分析純，廣東光華化學(xué)廠有限公司），水（超純水，實(shí)驗(yàn)室自制）.川黃口服液（批號分別為：1207308、1209183、1301242，四川升和藥業(yè)股份有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對照品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取5種對照品各10.0mg，置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并加至刻度，搖勻，經(jīng)0.22μm的微孔過濾膜過濾，對照品儲備液的質(zhì)量濃度為1.00g／L，在4℃下保存?zhèn)溆?，使用前用甲醇稀釋到所需的濃?

1.2.2 供試品溶液的配制 準(zhǔn)確量取益氣養(yǎng)血口服液5mL，置于5mL的EP管中，于12 000r／min下離心10min，將上清液置于另一5mL的EP管中，經(jīng)0.22μm的微孔過濾膜過濾備用.

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax RRHD Eclipse Plus C18（50mm×2.1mm，1.8μm），流動相：A相為乙腈溶液，B相為含0.1%甲酸的水溶液；流速：0.35mL／min；進(jìn)樣量：1μL；梯度洗脫程序：0～5min，90%～80%B；5～6min，80%～60%B；6～16min，60%～30%B；16～20mim，30%～0%B；20～24mim，0%～90%B.

1.2.4 質(zhì)譜條件 采用電噴霧電離源（ESI）正離子和負(fù)離子模式，多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM模式）.霧化氣：氮?dú)?，壓力?.8×105Pa；鞘氣：氮?dú)?，溫度?60℃，流速是12L／min.干燥氣：氮?dú)猓瑴囟仁?50℃，流速是10L／min.毛細(xì)管的電壓：4 000V，噴嘴電壓：0V.5種目標(biāo)組分的其他質(zhì)譜分析參數(shù)見表1.

表1 5種成分的部分質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 流動相的選擇 文中考察了乙腈-水和甲醇-水兩種流動相體系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用乙腈-水體系作為流動相5種成分分離良好且峰形對稱，而使用甲醇-水作為流動相時，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA4種物質(zhì)的色譜峰主要集中在16～17min，無法得到有效分離.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步比較5種物質(zhì)在不同濃度甲酸水（0.1%，0.2%，0.3%）條件下的靈敏度，結(jié)果表明，0.1%甲酸水最有利于提高靈敏度.

2.2 質(zhì)譜條件的選擇 文中分別采用了正離子和負(fù)離子檢測模式，結(jié)果顯示，黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、隱丹參酮、丹參酮ⅡA，在負(fù)離子模式下檢測不到，而在正離子模式下靈敏度較高，原兒茶醛在負(fù)離子模式下的靈敏度比在正離子模式下的靈敏度高.

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取5種對照品的儲備液，甲醇溶液稀釋，配制一系列不同質(zhì)量濃度的對照品，混 合，在 “1.2.3”和“1.2.4”的實(shí)驗(yàn)條件下測定，重復(fù)3次.以被測組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積的平均值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析，具體數(shù)據(jù)見表2.

表2 5種組分的線性方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍

2.4 精密度試驗(yàn) 同一批次待測樣品，按“1.2.2”制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”的實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)進(jìn)樣分析6次，根據(jù)色譜峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3.結(jié)果顯示，該方法有較良好的精密度.

化合物 精密度／% 穩(wěn)定性／% 重復(fù)性／%0.93 0.83 0.88黃芪甲苷 0.68 0.86 1.2黃芪皂苷Ⅱ 0.81 0.56 0.69隱丹參酮 0.95 0.91 1.1丹參酮Ⅱ原兒茶醛A 0.79 0.54 0.47

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 同一批次待測樣品隨機(jī)取6份，按“1.2.2”制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”的實(shí)驗(yàn)條件下測定，分別于0、2、4、8、12h進(jìn)樣測定，根據(jù)色譜峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果表明供試樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表3.

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 同一批次待測樣品隨機(jī)取6份，按“1.2.2”條制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”條的實(shí)驗(yàn)條件下測定，根據(jù)色譜峰面積計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見表3.結(jié)果表明供試樣品重復(fù)性良好.

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別精密量取已知這5種組分含量的同一批次川黃口服液各1mL，共9份，每組3份，加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品.按“1.2.2”條制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”條的實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)測定6次，分別計(jì)算回收率，結(jié)果見表4.

表4 5種組分在樣品中的加標(biāo)回收率（n＝3）

續(xù)表4

2.8 樣品含量測定 分別精密量取不同批號的樣品，按“1.2.2”條方法制備供試樣品，在“1.2.3”和“1.2.4”實(shí)驗(yàn)條件下連續(xù)測定6次.將各組分的峰面積代入回歸方程，結(jié)果見表5，對照品及樣品的分離情況見圖1.

圖1 對照品（A）和樣品（B）的UPLC-MS／MS色譜圖

3 結(jié)論

采用UPLC-MS／MS技術(shù)建立了同時測定川黃口服液中丹參酮ⅡA，隱丹參酮、黃芪甲苷、黃芪皂苷Ⅱ、原兒茶醛5種藥效成分含量的分析方法.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法靈敏度好、定量能力強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、快速、簡單.該方法的建立有利于進(jìn)一步完善川黃口服液及其類方的質(zhì)量控制及藥代動力學(xué)、藥物療效等相關(guān)研究.

表5 樣品含量結(jié)果 mg／L

［1］王保磊.川黃口服液治療白細(xì)胞減少癥19例［J］.中國醫(yī)藥指南，2010，4（8）：96.

［2］蔡梅，趙陸華，胡昌勤，等.高效毛細(xì)管電泳法測定香丹注射液中丹參素和原兒茶醛的含量［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，2001，32（2）：130-132.

［3］黃敬群，張秀巧，郭軍，等.高效液相色譜法測定5種不同產(chǎn)地丹參中丹參素和原兒茶醛含量［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，24（1）：37-40.

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