胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的細(xì)胞毒作用的研究

吳亞猛，張琳娜，陳思瑤，韓景春，那文婷，張 巍 (吉林醫(yī)藥學(xué)院：.臨床醫(yī)學(xué)院,2.生化教研室，吉林 吉林 3203)

宮頸癌每年的新發(fā)病例平均在13萬(wàn)例以上，在世界的年發(fā)病總數(shù)中，中國(guó)占到1/3到1/4之間，而且現(xiàn)在中國(guó)宮頸癌患者的年輕化趨勢(shì)越來(lái)越明顯[1]。腫瘤細(xì)胞增殖的研究是評(píng)價(jià)化療藥效的一個(gè)重要指標(biāo)[2]。胡桃醌(juglone,nuein)又名5-羥基-1,4-奈醌，是從胡桃楸新鮮根皮、枝條、青果皮中分離出來(lái)的羥基奈醌類(lèi)化合物，是胡桃楸中的主要毒性物質(zhì)[3]。為黃色針狀結(jié)晶，其熔點(diǎn)為155 ℃，微溶于熱水，易溶于氯仿和苯，溶于乙醇和乙醚，溶于堿性水溶液呈紫紅色，有升華性，具有抗腫瘤的活性，在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用，可誘導(dǎo)凋亡，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于胡桃醌抗腫瘤的報(bào)道[4]。本實(shí)驗(yàn)選用宮頸鱗癌caski細(xì)胞作為研究對(duì)象，探究胡桃醌對(duì)宮頸鱗癌的細(xì)胞毒作用，為胡桃醌的細(xì)胞毒作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

caski細(xì)胞吉林大學(xué)藥理教研室贈(zèng)予；胡桃醌購(gòu)自sigma公司；酶標(biāo)儀為BIO-BAD公司的MODEL 550型；LXJ-Ⅱ型離心沉淀機(jī)(上海醫(yī)用分析儀廠)；H110D電子分析天平(美國(guó)Sartorius)，倒置顯微鏡(上海醫(yī)用分析儀廠)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

caski細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生小牛血清的完全培養(yǎng)液中培養(yǎng)于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并拍照,適量時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 MTT比色法測(cè)胡桃醌的抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的caski細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞懸液密度為1×104個(gè)/mL,按100 μL/每孔接種于96孔培養(yǎng)板。并用胡桃醌與完全培養(yǎng)液配制成20、40、60、80、100 μmol/L不同的濃度培養(yǎng)，設(shè)置不加藥的對(duì)照組和不加MTT的空白對(duì)照組，復(fù)孔數(shù)為3。待細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液，給藥后培養(yǎng)24 h，期間在倒置顯微鏡下密切注意觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)并拍照。24 h后每孔加入20 μL MTT,37 ℃孵育4 h[5-6]，棄去上清后每孔加150 μL DMSO(二甲基亞砜)，在搖床上低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)得吸光度值并記錄結(jié)果。利用公式計(jì)算抑制率：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組吸光度值-空白組吸光度值)/(對(duì)照組吸光度值-空白組吸光度值)]×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)全部數(shù)據(jù)采用SPSS11.0軟件進(jìn)行分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用的形態(tài)觀察見(jiàn)圖1。在顯微鏡下可見(jiàn)未加胡桃醌細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，加胡桃醌后在顯微鏡下觀察細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周?chē)?xì)胞脫離，生長(zhǎng)狀態(tài)極差。

A:對(duì)照組；B:20 μmol/L；C:40 μmol/L; D:60 μmol/L E:80 μmol/L；F:100 μmol/L

2.2 胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞增殖的影響

不同濃度胡桃醌處理caski細(xì)胞24 h后采用MTT法測(cè)得各組吸光度，計(jì)算胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率，結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞的抑制率對(duì)胡桃醌的濃度呈明顯劑量相關(guān)性，胡桃醌的濃度分別為20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L。以空白組做對(duì)照，測(cè)得各組OD值(見(jiàn)圖2)。從圖中可看出不同濃度胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的生長(zhǎng)均有抑制作用，各組與對(duì)照組比較有顯著差異。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可計(jì)算出胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞的IC50為77.27 μmol/L。

圖 2 不同濃度胡桃醌對(duì)caski細(xì)胞增殖的影響

*P<0.05,**P<0.01

3 討 論

胡桃醌是從胡桃楸新鮮根皮、枝條、青果皮中分離出的羥基奈醌類(lèi)化合物，是胡桃楸中主要的毒性物質(zhì)，是肽基脯氨酰同分異構(gòu)酶家族成員的特異性抑制劑[7]。本實(shí)驗(yàn)選用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及MTT法對(duì)其抗增殖及誘導(dǎo)凋亡進(jìn)行初步的測(cè)定，測(cè)定出胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞最佳的抑制濃度。倒置顯微鏡下可見(jiàn)陰性對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，不同濃度胡桃醌處理后細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制，生長(zhǎng)狀態(tài)差，在顯微鏡下細(xì)胞皺縮，且劑量呈依賴性。以上結(jié)果表明胡桃醌對(duì)宮頸癌caski細(xì)胞的增殖有抑制作用，但其在誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，凋亡相關(guān)基因的變化及凋亡信號(hào)的產(chǎn)生還有待深入研究，以進(jìn)一步闡述胡桃醌的作用機(jī)理。

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