膠體金免疫層析法檢測飼料中玉米赤霉烯酮的殘留

劉宏軍 馮才茂 王瑟如 吳發(fā)振 余厚美 仲曉蘭

（①江蘇省泰州市姜堰區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所 225500 ②北京勤邦生物技術有限公司）

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等動物源性食品，會對動物及人類造成危害，主要表現(xiàn)在影響和破壞生長發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后，會引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴重損傷。此外，ZEN及其衍生物對肝臟系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性[1,2]。

目前大多數(shù)國家對食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴格的規(guī)定。例如澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.05mg/kg；意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.1mg/kg；而在法國，植物油和谷類當中玉米赤霉烯酮的含量必須低于0.2mg/kg。中國則規(guī)定配合飼料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超過500ng/g。

玉米赤霉烯酮的分析測定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)[3-9]。TLC法繁瑣費時，且靈敏度、特異性較差，提取過程中所需有機溶劑品種多且量大，易污染環(huán)境，對人體有較大危害。常規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高，但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣，操作復雜，不宜推廣。以上包括ELISA法在內(nèi)的幾種方法均耗時較長，而隨著商品經(jīng)濟的發(fā)展，人們對時間概念的加強，無論是商家還是政府部門對檢測時間的要求越來越高，因此，膠體金試紙條作為一種快速檢測技術，能很好的解決這個問題，提高檢測效率，縮減檢測時間。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

飼料樣品購自市場；玉米赤霉烯酮標準品購自美國Sigma公司；玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條來自北京勤邦生物技術有限公司；微量移液器購自美國Thermo公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣制備 樣本前處理方法：稱取5.0±0.05g粉碎的飼料樣品至50ml聚苯乙烯離心管中，加入5ml甲醇，將瓶塞蓋緊，振蕩5min；室溫(20～25℃)，3000r/min以上離心5min；移取0.1ml上清液至盛有0.9ml樣本復溶液的2ml聚苯乙烯離心管中混勻，渦動30s。陰性飼料樣品：空白飼料樣品經(jīng)前處理后，配制成濃度分別為0和該試紙條檢測限下限的1/2。陽性飼料樣品：空白飼料樣品經(jīng)前處理后，配制成濃度分別為該試紙條檢測限和檢測限的2倍。

1.2.2 試紙條的使用步驟 用吸管吸取稀釋后的待檢樣品溶液垂直滴加3滴于加樣孔；液體流動時開始計時，反應5～10min，判定結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定 如果C線和T線都顯色，無論顏色深淺，均表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度低于檢測限，為陰性結(jié)果；如果C線顯色，T線不顯色，表示飼料樣品中玉米赤霉烯酮濃度等于或高于檢測限，為陽性結(jié)果；如果未出現(xiàn)C線，表明不正確的操作過程或試紙條已變質(zhì)失效(如附圖)。

附圖 玉米赤霉烯酮快速檢測試紙條示意圖

1.2.4 檢測限的測定 用玉米赤霉烯酮試紙條分別對添加不同濃度的陰性飼料、陽性飼料進行檢測，每個樣品做2個重復，記錄每種呈現(xiàn)陽性的最低濃度值。如果檢測限下限濃度的陽性飼料樣品不呈現(xiàn)陽性，則根據(jù)檢測限(檢測限有下限和上限的則在檢測限內(nèi)選擇更高的濃度進行檢測)配制濃度更高的陽性飼料樣品進行檢測，直至出現(xiàn)陽性結(jié)果為止。

1.2.5 假陽性率的測定 取空白的飼料樣品50份，制備B1、B2、B3、……、B50等100份陰性飼料樣品。對陰性飼料樣品用試紙條檢測，每個樣品做2個重復，統(tǒng)計假陽性數(shù)，按照下面的公式計算假陽性率。

1.2.6 假陰性率的測定 取空白的飼料樣品50份，制備B1、B2、B3、……、B50等100份陽性飼料樣品，對陽性飼料樣品用試紙條檢測，每個樣品做2個重復，統(tǒng)計假陰性數(shù)，按照下面的公式計算假陰性率。

2 結(jié)果

用玉米赤霉烯酮試紙條對飼料進行了檢測限、假陽性率、假陰性率驗證，結(jié)果如附表。

附表 試紙條檢測結(jié)果

3 討論

玉米赤霉烯酮試紙條的檢測限為500ng/g，符合GB 13078.2-2006《飼料衛(wèi)生標準 飼料中赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮的允許量》。同時，國內(nèi)外對于快速檢測技術的一個基本原則是：絕不能有假陰性，但允許有假陽性，按照農(nóng)業(yè)部獸藥殘專家委員會《獸藥殘留檢測試紙條(條、卡)備案技術資料要求及審查工作程序》，快速試紙條的假陽性率應小于5%。本試紙條符合國家標準和該備案技術要求。

玉米赤霉烯酮試紙條操作簡便，結(jié)果容易觀察，不需要任何設備，整個操作時間僅需5～10min，相對與儀器等方法，具有工作量小，成本低的明顯優(yōu)勢，十分適用于我國基層檢測實驗室、政府部門的市場監(jiān)控檢測、臨時抽檢、排查工作，能夠?qū)崿F(xiàn)生物技術在食品安全流通消費領域的方便、快速檢測[10]。

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