化濁通脈散對(duì)ASO家兔ICAM-1指標(biāo)表達(dá)的影響

李慎賢，吳 迪，程 磊，陳蘇寧，金鐘太，胡 瑩

0 引言

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥(ASO)是一種常見病、多發(fā)病，為退行性病變，是大、中動(dòng)脈硬化的基本病理過(guò)程。主要是細(xì)胞纖維基質(zhì)、脂質(zhì)和組織碎片的異常沉積，在動(dòng)脈內(nèi)膜或中層發(fā)生增生的過(guò)程中的復(fù)雜病理變化。近年來(lái)，ASO發(fā)病呈現(xiàn)明顯的增高趨勢(shì)。研究表明，中醫(yī)藥在治療ASO方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀、因人制宜、組方靈活、副作用小的特點(diǎn)[1]。筆者觀察化濁通脈散對(duì)實(shí)驗(yàn)性ASO家兔模型的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg，由我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(遼)2009-0002。化濁通脈散組成：黃芪、金銀花、膽星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九藥業(yè)集團(tuán)提供，批號(hào)：0807021。通塞脈片，由江蘇南星藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制藥有限公司提供，批號(hào)：120708T。膽固醇：由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑沈陽(yáng)有限公司提供，批號(hào)：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批號(hào)：20120106。

主要試劑：Triozol Reagent，美國(guó)Invitrogen Life technologies公司；引物合成，北京華大基因公司；熒光定量PCR試劑盒，大連寶生物。血脂系列試劑由我院生化室提供。

主要儀器：德國(guó)eppendorf5417R離心機(jī)，雅培ARCHITECTci8200全自動(dòng)生化免疫分析儀，小型臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)SIGMA，1-13)，高速冷凍離心機(jī) sigma 31k5C型，美國(guó)PCR擴(kuò)增儀(德國(guó)Biometra)，紫外分光光度計(jì)(英國(guó)UV-visible Spectrometer，UV300)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物選擇及分組 選用健康純種新西蘭雄性白兔50只，10月齡，體重2.8～3.0 kg。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，排除飲食異常者。1周后隨機(jī)分為5組，每組10只：正常組、模型組、化濁通脈散組、通塞脈片組、西洛他唑組。

1.2.2 造模 正常組喂養(yǎng)普通飼料，自由飲水。其余4組自實(shí)驗(yàn)開始喂高脂飲食，每只每日在正常飼料中加膽固醇1 g、豬油5 g。第3天開始，均在10%烏拉坦麻醉下由左側(cè)股動(dòng)脈插管，4F氣囊導(dǎo)管拖拉右側(cè)髂股動(dòng)脈8次，造成機(jī)械性內(nèi)膜損傷[2-3]。實(shí)驗(yàn)第7天，模型組、實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組經(jīng)耳緣靜脈一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg造成免疫性內(nèi)皮損傷；正常組注射等量生理鹽水。至20周末，動(dòng)物模型出現(xiàn)室內(nèi)放行時(shí)后腿拖拉或跛行，表示造模成功。

1.2.3 藥物治療 從21周開始至24周末，各組改為正常飲食，開始進(jìn)行藥物干預(yù)。中藥治療組予化濁通脈散，按生藥7.2 g/(kg·d)，用量按70 kg成人用量3.3倍計(jì)算；中藥對(duì)照組予通塞脈片0.75片/(kg·d)，按60 kg體重成人每日用量20片計(jì)算；西藥對(duì)照組予西洛他唑片4.5 mg/(kg·d)，按60 kg體重成人的人兔體表?yè)Q算公式計(jì)算，均混入飼料中喂養(yǎng)。

1.2.4 取材及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ICAM-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量 取材：實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將動(dòng)物用乙醚麻醉，解剖切取股動(dòng)脈血管多段，長(zhǎng)約0.2～0.3 cm，放到盛有1 mL Trizol的1.5 mL EP管中保存，制備實(shí)驗(yàn)標(biāo)本，然后處死動(dòng)物。

液體配制：①DEPC水：吸出1 mL，放于1 000 mL雙蒸水中配成1‰ DEPC水，放于1 000 mL容量瓶中靜置4 h備用。②75%乙醇：無(wú)水乙醇+DEPC水，放于-20 ℃保存(DEPC水需先高壓)。

引物設(shè)計(jì)：目的基因RealTime PCR檢測(cè)引物，設(shè)計(jì)引物見表1。

表1 引物設(shè)計(jì)

操作步驟：參照Trizol說(shuō)明書采取一步法提取總RNA。采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定260、280 nm的OD值，二者比值在1.8～2.0之間，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。應(yīng)用ABI 7500 擴(kuò)增儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃ 0.5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度而對(duì)PCR產(chǎn)物定量。

2 結(jié)果

根據(jù)RT-PCR原始檢測(cè)結(jié)果，儀器可自動(dòng)按設(shè)定的分析方法計(jì)算出各樣品的目的基因相對(duì)定量結(jié)果，即其他各個(gè)樣品相對(duì)于正常組目的基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異-2-△△ct值，見表2。各組中ICAM-1的mRNA相對(duì)表達(dá)量見圖1。由圖1可見，B、C、D、E組的ICAM-1 mRNA表達(dá)水平高于A組(P<0.01)，C、D、E組的ICAM-1 mRNA表達(dá)水平低于B組(P<0.01)，D、E組的ICAM mRNA表達(dá)水平高于C組(P<0.01)。ICAM-1、GAPDH的擴(kuò)增曲線和溶解曲線見圖1。結(jié)果表明，PCR的擴(kuò)增效率及產(chǎn)物特異性均高，排除了非特異性產(chǎn)物的干擾。

表2 各組對(duì)ICAM-1 mRNA表達(dá)的影響

圖1 ICAM-1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥屬中醫(yī)“脈痹”、“脫疽”[4]、“血癖”范疇，在古典文獻(xiàn)中多有記載。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，本病與飲食失節(jié)、臟腑虧虛、經(jīng)脈痹阻等有密切關(guān)系[5]。飲食失節(jié)，膏粱厚味，損傷脾胃，濕濁內(nèi)生，痰癖互結(jié)，阻塞經(jīng)脈；或因氣血虧虛，運(yùn)行無(wú)力，脈絡(luò)癖阻，氣虛血癖，經(jīng)脈痹阻，氣血不達(dá)四末而發(fā)為“脈痹”?；蛞蚋文I虧虛，氣竭精傷，腎水消灼，筋練骨枯，而成“脫疽”之癥。氣血淤滯不通、肢體失榮是其標(biāo)，脾失健運(yùn)、痰濕脂濁壅積、阻滯經(jīng)脈是其本。本研究遵循“治病務(wù)求其本”的原則，以化痰健脾、益氣通脈為治療方法，組成化濁通脈散(黃芪、川芎、水蛭、金銀花、膽南星、半夏、茯苓、白術(shù)、澤瀉、焦山楂、延胡索)。此方從中醫(yī)角度加強(qiáng)了古方的活血化瘀、化濁通脈作用，從西醫(yī)方面加強(qiáng)了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管內(nèi)壁動(dòng)脈硬化斑塊形成的作用。重用黃芪：補(bǔ)氣，使氣旺則血行，瘀消而不傷正，為君藥。川芎、水蛭：活血祛瘀，為臣藥。膽南星、半夏：祛痰泄?jié)嵬ńj(luò)；澤瀉：利水滲濕；焦山楂：消痰化瘀；金銀花：清熱解毒；延胡索：行氣止痛，行血中之氣，又能行氣中之血。以上共為佐藥。全方共同組成益氣化瘀通絡(luò)、健脾祛痰化濁之功。

研究表明，黃芪能抑制血小板粘附，消除自由基，減少過(guò)氧化脂質(zhì)，穩(wěn)定細(xì)胞膜，增強(qiáng)機(jī)體非特異性免疫功能[6-9]。金銀花具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗血小板聚集、降低膽固醇、抗氧化等作用[10]。白術(shù)能增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，具有明顯的抗氧化作用。川芎對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞有保護(hù)作用，對(duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖有抑制作用，可改善血液循環(huán)，調(diào)節(jié)血脂。半夏有降壓作用。茯苓可抗氧化、抗炎、提高免疫力[11]。澤瀉具有降低血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗血栓形成及增強(qiáng)纖溶酶活性等作用，能從降低血脂、抑制內(nèi)皮細(xì)胞損傷、抗血栓等多個(gè)方面抑制或減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[12]。水蛭具有抗凝、抗血栓、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及抗炎的作用，研究表明，水蛭中的水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的凝血酶特異性抑制劑[13]。膽南星可鎮(zhèn)痛，研究表明，5%膽南星水溶液的鎮(zhèn)痛率為90.91%[14]。焦山楂有降血脂的作用[15]。延胡索中的生物堿具有很強(qiáng)的鎮(zhèn)痛、降壓的作用，四氫黃連堿對(duì)二磷酸腺苷、花生四烯酸和膠原誘導(dǎo)的兔血小板聚集均有抑制作用[16]。以上藥理學(xué)研究表明，此方從降低血脂、抗氧化消除自由基、抗凝血、抗血栓形成、抗炎、增強(qiáng)纖溶酶活性、保護(hù)血管內(nèi)皮等方面發(fā)揮作用，可改善下肢血液循環(huán)，抑制血管內(nèi)壁動(dòng)脈硬化斑塊的形成。本研究結(jié)果表明，化濁通脈散可以起到防治ASO的目的。

研究認(rèn)為，高脂血癥是下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的一種危險(xiǎn)因素[17]，本研究亦證實(shí)了此觀點(diǎn)。TC、TG、LDL過(guò)高都是下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥的危險(xiǎn)因子。LDL是致動(dòng)脈粥樣硬化的基本因素，其通過(guò)血管內(nèi)皮進(jìn)入血管壁內(nèi)，在內(nèi)皮下滯留的LDL被修飾成氧化型LDL(ox-LDL)，ox-LDL不能被正常LDL受體識(shí)別，而被巨噬細(xì)胞的清道夫受體識(shí)別而快速攝取，巨噬細(xì)胞吞噬ox-LDL后形成泡沫細(xì)胞，后者不斷地增多、融合，構(gòu)成了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心。ox-LDL可刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的黏附分子、化學(xué)趨化分子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞毒素等，進(jìn)一步促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展[18]。而HDL能移除外周組織的膽固醇，轉(zhuǎn)運(yùn)給肝臟進(jìn)行分解代謝。也有研究提示，HDL還可能通過(guò)抗炎、抗氧化和保護(hù)血管內(nèi)皮功能而發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用，具有防治動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的作用。研究表明，化濁通脈散雖對(duì)HDL作用不明顯，但對(duì)TG、LDL有較明顯的抑制作用，亦減輕了以上LDL促動(dòng)脈粥樣硬化的作用，說(shuō)明化濁通脈散可通過(guò)減低血脂來(lái)抑制動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，動(dòng)脈硬化病變是從受累動(dòng)脈的內(nèi)膜開始，近年來(lái)多數(shù)學(xué)者支持內(nèi)膜損傷炎癥反應(yīng)學(xué)說(shuō)，認(rèn)為完整的內(nèi)皮細(xì)胞是動(dòng)脈的生理屏障，基于其擴(kuò)血管、抗凝、抗血小板、抗脂質(zhì)沉積和抗縮血管物質(zhì)的綜合作用，才能夠保證血液的正常流動(dòng)，防止血栓和AS的形成。如果內(nèi)皮細(xì)胞遭受廣泛和嚴(yán)重的損害，就會(huì)出現(xiàn)與之相反的病理生理變化。ICAM-1是免疫球蛋白超家族的成員，在中性粒細(xì)胞遷移和內(nèi)皮細(xì)胞粘附導(dǎo)致動(dòng)脈硬化過(guò)程中起重要作用[19]。正常內(nèi)皮細(xì)胞中ICAM-1表達(dá)很低，炎癥反應(yīng)開始時(shí)，多種炎性介質(zhì)及細(xì)胞因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞，使ICAM-1等表達(dá)增加[20-22]，白細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞跨膜游出，趨向炎癥灶，大量單核細(xì)胞粘附于損傷內(nèi)皮表面，并跨過(guò)內(nèi)皮層進(jìn)入內(nèi)皮下基質(zhì)，吞噬大量脂質(zhì)，變?yōu)榧せ畹木奘杉?xì)胞，最后成為泡沫細(xì)胞[23]。ICAM-1還介導(dǎo)淋巴細(xì)胞聚集在損害部位，導(dǎo)致斑塊內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)增加，通過(guò)分泌各種水解酶導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定[24]。在動(dòng)脈硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。ICAM-1是ASO早期的病理變化的促進(jìn)因素，并與其嚴(yán)重程度有關(guān)[25]。

綜上所述，化濁通脈散可有效降低ICAM-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)，因此可有效防治動(dòng)脈硬化斑塊的形成與發(fā)展。

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