右美托咪定對高血壓腦出血大鼠血腫周圍細胞凋亡的影響

欒宏權(quán)，姚柱煒，蒙劍鋒

0 引言

高血壓腦出血(HICH)是腦血管病中病死率和致殘率很高的一種疾病。我國老年(>60歲)人口已超過1.3億，這種以老年人為主要發(fā)病人群的疾病應(yīng)當(dāng)引起研究者的重視，以探索其有效的防治措施[1]。研究表明，細胞凋亡機制參與腦出血后繼發(fā)性腦損傷[2]。右美托咪定是咪唑類衍生物，是一種高選擇性的腎上腺α受體激動劑，通過激動中樞神經(jīng)系統(tǒng)α受體最密集的區(qū)域-腦干部藍斑，引發(fā)生理非動眼睡眠狀態(tài)，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、催眠作用，降低血壓及心率[3]。研究發(fā)現(xiàn)，右美托咪定在動物腦缺血模型中有神經(jīng)保護作用，可減輕腦損傷[4]。本研究擬評價右美托咪定對高血壓腦出血大鼠血腫周圍細胞凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料與方法 健康雄性SD大鼠(青島大學(xué)實驗動物科學(xué)部提供)150只，體重250～300 g，采用隨機數(shù)字表分為5組：對照組(C組)、假手術(shù)組(S組)、高血壓腦出血模型組(M組)、右美托咪定組(D組)和生理鹽水組(N組)，每組30只。D組于制作模型前經(jīng)腹腔注射鹽酸右美托咪定注射液100 μg/kg(批號：14030332，江蘇恒瑞)，N組注入等量生理鹽水，C組不行任何處理。

1.2 模型建立 參照文獻[5]制備大鼠高血壓腦出血模型。用內(nèi)徑0.2 mm的銀夾狹窄雙側(cè)腎動脈造成大鼠腎血管性高血壓，術(shù)后60 d形成穩(wěn)定的高血壓后，在立體定位下于大鼠右側(cè)向腎血管性高血壓大鼠右側(cè)尾狀核(前囟前0.2 mm，矢狀縫右3 mm，深6 mm)注入含0.4 U細菌膠原酶(Ⅶ型)的生理鹽水2 μL，誘導(dǎo)腎血管性高血壓腦出血大鼠模型。假手術(shù)大鼠麻醉、開腹、鈍性分離雙側(cè)腎動脈后關(guān)腹，60 d后向右側(cè)尾狀核內(nèi)注入2 μL生理鹽水。

1.3 檢測指標(biāo) ①神經(jīng)行為學(xué)評估：動物于制備模型結(jié)束后放回籠中進行觀察，自由飲食。高血壓腦出血后24 h，采用雙盲法評估并記錄每只小鼠神經(jīng)行為學(xué)評分，采用Lawner等制定的評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，包括6個方面：眼瞼下垂情況(正常，0分；一側(cè)眼瞼部分下垂，1分；一側(cè)眼瞼完全下垂，2分；兩側(cè)眼瞼部分下垂，3分；兩側(cè)眼瞼完全下垂，4分)，毛發(fā)豎立情況(正常，0分；出現(xiàn)毛發(fā)豎立，1分)，肢體肌張力(正常，0分；肌力下降，1分)，屈肌反射(正常，0分；后肢屈肌反射下降，1分；后肢完全不能屈曲，2分)，姿勢(正常，0分；伏首前傾，1分)，行走方式(正常，0分；速度減慢，1分；不能行走，2分)。②血腫周圍腦組織TUNEL染色及凋亡分析：高血壓腦出血后1、3、5 d，每組隨機選取5只大鼠，取血腫周圍約2 mm厚腦組織，4%多聚甲醛常溫固定包埋，切片，脫蠟，其余步驟按照說明書進行。顯微鏡下采集圖像，凋亡細胞細胞核顯色為棕褐色。每張切片隨機取5個高倍鏡(400×)視野，分別計數(shù)陽性細胞核個數(shù)和細胞核總數(shù)，兩者比值定義為該切片凋亡指數(shù)。③檢測大鼠血腫周圍細胞Bcl-2和Bax的表達情況：高血壓腦出血后1、3、5 d，每組隨機選取5只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛麻醉(0.45 mL/100 g)?？焖俦蠑囝^取腦，分離出血腫周圍約2 mm厚腦組織，迅速放入-80 ℃冰箱保存。蛋白變性，標(biāo)本于-20 ℃冰箱保存。電泳槽通電，進行濕法轉(zhuǎn)膜。一抗反應(yīng)：脫脂奶粉配制的一抗稀釋液3 mL，加入一抗，混勻，放入轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜，趕出氣泡并封口，4 ℃過夜。洗膜，孵育二抗，洗二抗，顯影。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)行為學(xué)評估 與C組、S組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分升高(P<0.05)；與M組比較，D組大鼠評分降低(P<0.05)；與D組比較，N組大鼠評分升高(P<0.05)。C組與S組、M組與N組評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠HICH 24 h神經(jīng)行為學(xué)評分及各時點血腫周圍腦組織凋亡指數(shù)

2.2 血腫周圍腦組織原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)染色及凋亡分析 與C組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后1、3、5 d時血腫周圍腦組織凋亡細胞增加(P<0.05)；與M組比較，D組凋亡細胞減少(P<0.05)；與D組比較，N組凋亡細胞增加(P<0.05)。C組與S組、M組與N組凋亡數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、圖1。

圖1 大鼠血腫周圍腦組織TUNEL染色(×400)

2.3 檢測大鼠血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax的表達情況 與C組比較，M組、D組和N組大鼠高血壓腦出血后血腫周圍腦組織Bcl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)(P<0.05)；與M組比較，D組Bcl-2表達上調(diào)，Bax表達下調(diào)(P<0.05)；與D組比較，N組Bcl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)(P<0.05)。C組與S組、M組與N組Bcl-2和Bax表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2、圖2。

表2 各組大鼠高血壓腦出血后血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax表達水平比較

圖2 各組大鼠血腫周圍腦組織Bcl-2和Bax表達情況

3 討論

高血壓性腦出血是高血壓病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，男性略多，冬春季易發(fā)。研究表明，腦出血后由于血腫占位效應(yīng)的直接損傷、繼發(fā)性腦缺血、炎癥反應(yīng)和炎癥因子的損傷作用、興奮性氨基酸的毒性作用、氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、紅細胞裂解產(chǎn)物鐵離子和血紅蛋白的神經(jīng)毒作用和血液凝固釋放的凝血酶的神經(jīng)毒作用等因素導(dǎo)致血腫周圍組織細胞凋亡，因此，調(diào)節(jié)細胞凋亡的發(fā)生成為腦出血治療的新靶點[7]。

B細胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)家族的Bcl-2、Bax基因組成一個平衡體系，共同調(diào)節(jié)細胞凋亡。Bcl-2基因表達的產(chǎn)物主要位于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和核膜上，其功能與抑制細胞凋亡、延長細胞生存有關(guān)。Bcl-2蛋白可抑制多種損傷因素導(dǎo)致的神經(jīng)細胞凋亡，而Bax的生物作用與Bcl-2相反，當(dāng)Bax表達增高可促進細胞凋亡。因此，本研究采用Bcl-2和Bax反映老齡大鼠短暫腦缺出血再灌注損傷后細胞凋亡情況。

本研究參照文獻[5]制備大鼠高血壓腦出血模型。結(jié)果顯示，M組大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分升高，血腫周圍腦組織凋亡細胞增加，提示大鼠高血壓腦出血模型制備成功。參照文獻[8]選擇腹腔注射鹽酸右美托咪定100 μg/kg。結(jié)果顯示，腹腔注射右美托咪定后，大鼠高血壓腦出血后24 h神經(jīng)行為學(xué)評分降低，1、3、5 d時血腫周圍腦組織凋亡細胞減少，Bcl-2表達上調(diào)，Bax 表達下調(diào)，提示右美托咪定可能通過上調(diào)Bcl-2和下調(diào)Bax表達，抑制大鼠高血壓腦出血血腫周圍組織細胞凋亡，從而減輕腦損傷。其機制可能是通過Madm-2抑制P53的活性，下調(diào)Bax和上調(diào)Bcl-2表達，產(chǎn)生抗凋亡作用[9]；通過α2-腎上腺素受體—腺苷酸環(huán)化酶通道，增加磷酸化的FAK含量，再介導(dǎo)FAK-Ras-MAPK通路和FAS-PI3K通路，上調(diào)Bcl-2表達的同時下調(diào)Bax的表達，發(fā)揮抗凋亡作用[10]；降低大腦缺血的大鼠血漿中的兒茶酚胺的濃度[11]，產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。

綜上所述，右美托咪定可抑制高血壓腦出血大鼠血腫周圍腦組織細胞凋亡，從而減輕腦損傷，其機制可能與上調(diào)血腫周圍腦組織Bcl-2表達和下調(diào)Bax表達有關(guān)，更多保護機制有待在今后的研究中進一步證實。

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