右美托咪定對感染性休克大鼠脾臟及胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的影響

姬 斌，秦培順，南 洋，黃蔥蔥，李 軍

0 引言

感染性休克亦稱膿毒性休克，主要由革蘭陰性菌及該菌產(chǎn)生的內(nèi)毒素過度刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生過量炎性細(xì)胞因子[1]。感染性休克是臨床危重患者常見死亡原因，盡管有多種先進(jìn)的治療方法，但在重癥病房的致死率依然高達(dá)20%以上[2]。目前研究成果表明，感染性全身炎癥反應(yīng)患者的炎癥細(xì)胞因子和免疫蛋白主要在脾臟巨噬細(xì)胞內(nèi)生成，胸腺組織中也有體現(xiàn)[3]。本次研究采用內(nèi)毒素制備感染性休克大鼠模型，采用右美托咪定予以干預(yù)，觀察大鼠血清IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-2的水平，并檢測脾臟及胸腺caspase-3、caspase-8和caspase-9活性及淋巴細(xì)胞凋亡情況。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物模型制作 選取雄性12周齡Walse大鼠36只(由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SYXY(浙)2009-0129)，每籠3只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：空白組(S組)、內(nèi)毒素組(E組)和右美托咪定治療組(D組)。S組：靜脈持續(xù)泵入0.9%生理鹽水1.0 mL/(kg·h)；E組：靜脈注射內(nèi)毒素15 mg/kg，2 min后持續(xù)泵入0.9%生理鹽水，劑量1.0 mL/(kg·h)；D組：靜脈注射內(nèi)毒素15 mg/kg，2 min后持續(xù)泵入右美托咪定(鹽酸右美托咪定注射液，商品名：艾貝寧，規(guī)格:200 μg/2 mL，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號：H20110086)，劑量:5 μg/(kg·h)。

1.2 研究方法 用藥0.5、1、2、3、4、6 h后，每組選取存活Walse大鼠6只，頸動脈采血1 mL[2]，檢測血清中IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-2等炎性細(xì)胞因子水平，6 h后存活者以脫頸法處死，分離脾臟及胸腺組織，用10%福爾馬林溶液固定后，石蠟包埋、切片，于-70 ℃環(huán)境保存。

1.2.1 炎性細(xì)胞因子檢測 采用ELISA(酶聯(lián)吸附法)檢測3組大鼠血清IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-2的含量，儀器選用μ-Quant酶標(biāo)分光光度儀(美國Bio-Tek公司)、ELISA檢測試劑盒(BIoSoURCE公司)。

1.2.2 脾臟及胸腺caspase-3、caspase-8和caspase-9活性檢測 采用免疫組織化學(xué)染色法檢測。將脾臟、胸腺石蠟切片分別脫蠟、內(nèi)源性過氧化物酶封閉后，分別滴加兔抗鼠caspase-3、caspase-8和caspase-9多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，滴度1∶100)，PBS代替一抗做陰性對照。40 ℃過夜后滴加二抗，二抗為生物素標(biāo)記羊抗小鼠1gG(Santa Cruz公司，滴度1∶200)，DAB(美國Sigma公司)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片[4]。采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像分析。

1.2.3 淋巴細(xì)胞凋亡檢測 取脾臟、胸腺石蠟切片進(jìn)行脫蠟、粉碎處理，經(jīng)400目不銹鋼篩網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清，PBS漂洗2次，重懸PBS溶液中室溫孵育30 min后加入碘化丙啶(PI)染色，400目尼龍網(wǎng)再次過濾后，采用FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國Beckman公司)檢測，操作按說明書要求進(jìn)行。

1.2.4 淋巴細(xì)胞亞群的檢測 取脾臟、胸腺單細(xì)胞懸液PBS漂洗2次，采用雙管標(biāo)記檢測法，即采用CD4、CD8和IFN-γ FITC三色標(biāo)記一管檢測Th1細(xì)胞，CD4、CD8和IL-4 PE三色標(biāo)記一管檢測Th2細(xì)胞。室溫孵育15 min、SBP洗滌2次后，每管分為2份，分別加入APC標(biāo)記的anti-mouse IFN-γ和IL-4與各自的同型對照，計(jì)算Th1(CD4+/IFN-γ+)和Th2(CD4+/IL-4′)的百分率。

1.2.5 圖像分析 采用Image-pro PLUS 6.0彩色病理圖像分析系統(tǒng)對切片進(jìn)行圖像分析，采用陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)法，每張切片在高倍鏡下隨機(jī)選取4個(gè)無重疊視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值記錄。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中各細(xì)胞因子濃度情況 與S組相比，E組、D組大鼠血清的抗炎因子IL-4、IL-10水平和促炎因子IFN-γ、IL-2均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；隨治療時(shí)間延長，E組的IL-4、IL-10水平降低，IFN-γ、IL-2水平升高；D組的IL-4、IL-10水平升高，IFN-γ、IL-2水平降低，兩組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2 三組大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡情況 與S組相比，E組、D組的大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與E組相比，D組大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且caspase-9表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)減少幅度最為明顯。見表2。

2.3 三組大鼠胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡情況 與S組相比，E組、D組的大鼠胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與E組相比，D組大鼠胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且caspase-9表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)減少幅度最為明顯。見表3。

表1 三組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)血清中各細(xì)胞因子濃度比較(ng/L)

表2 三組大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/400倍野)

表3 三組大鼠脾臟caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)比較(個(gè)/400倍野)

2.4 E組和D組的Th1/Th2比率比較 D組大鼠脾臟及胸腺Th1/Th2比率均顯著高于E組，兩組的脾臟及胸腺Th1/Th2比率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 E組和D組的Th1/Th2比較(%)

3 討論

IFN-γ和IL-2屬于促炎因子，IFN-γ主要由Thl與Tcl細(xì)胞分泌，IL-2由Thl細(xì)胞分泌；IL-4和IL-10屬于抗炎因子，主要由Th2細(xì)胞分泌[5]。發(fā)生感染性休克后，機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)體系迅速啟動，多種炎性細(xì)胞因子被釋放進(jìn)入微循環(huán)[6]?，F(xiàn)有研究結(jié)果表明，感染可以使免疫應(yīng)答或向Thl或向Th2極化，這對成功控制感染和避免免疫能力下降的修復(fù)都非常重要[7]。Nikonenko等[8]認(rèn)為，促炎因子介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，誘導(dǎo) Thl細(xì)胞產(chǎn)生 IFN-α，增大 T淋巴細(xì)胞和 NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。Boyman等[9]認(rèn)為，IL-2水平與T淋巴細(xì)胞的免疫功能呈正相關(guān)，IL-2水平下降，T淋巴細(xì)胞的免疫清除能力就減弱，導(dǎo)致免疫損傷。Foitzik等[10]的研究則顯示，IL-10的抗炎作用在機(jī)體內(nèi)十分普遍，貫穿炎癥反應(yīng)的所有環(huán)節(jié)，其抑制炎癥、維持細(xì)胞因子平衡的作用已被眾多學(xué)者認(rèn)可。而IL-4具有顯著的抗炎作用，可以有效抑制內(nèi)毒素(LPS)介導(dǎo)的炎性因子產(chǎn)生[11]，Th2細(xì)胞也主要通過IL-4參與機(jī)體免疫反應(yīng)，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)進(jìn)行不同種類的免疫應(yīng)答反應(yīng)[12]。

炎性反應(yīng)早期，促炎因子處于優(yōu)勢，引發(fā)淋巴細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致caspase-8聚合而發(fā)生激活，隨機(jī)產(chǎn)生caspase蛋白酶解級聯(lián)反應(yīng)，并進(jìn)一步激活其同源酶。caspase-3通常是以無活性前體存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入凋亡時(shí)才被激活；caspase-8的級聯(lián)反應(yīng)也能夠促使caspase-3激活[13]。細(xì)胞色素C(Cyt C)在細(xì)胞凋亡早期從線粒體膜間隙進(jìn)入細(xì)胞漿中參與激活caspase-9，再激活caspase-3發(fā)生鏈?zhǔn)缴镄?yīng)，最終使細(xì)胞DNA斷裂、細(xì)胞開始凋亡。激活后的caspase能再次促使線粒體釋放Cyt C，使細(xì)胞凋亡形式更加嚴(yán)重[14]。右美托咪定是一種高選擇性α腎上腺素受體激動藥[15]，具有減輕炎癥介質(zhì)的釋放和部分抑制炎癥因子的放大效應(yīng)，使去甲腎上腺素的釋放減少，而去甲腎上腺素的水平具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)的重要作用。因此，右美托咪定可能是通過減少去甲腎上腺素的釋放而使炎癥反應(yīng)減輕，并改善免疫能力[16]。

本研究采用右美托咪定干預(yù)治療感染性休克大鼠，結(jié)果IL-4、IL-10水平隨治療時(shí)間延長而升高，IFN-γ、IL-2水平降低，說明Th1/Th2隨治療時(shí)間而升高，此結(jié)果與Memisx等[17]的研究成果一致。本研究結(jié)果表明，右美托咪定干預(yù)治療可使感染性休克大鼠Th1/Th2升高。右美托咪定干預(yù)使感染性休克大鼠脾臟及胸腺caspase-3、caspase-8、caspase-9表達(dá)及淋巴細(xì)胞凋亡的陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少，且caspase-9表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)減少幅度最為明顯。因此，右美托咪定可能通過調(diào)節(jié)感染性休克大鼠機(jī)體內(nèi)的炎性反應(yīng)，促進(jìn)Th1/Th2平衡，減少淋巴細(xì)胞凋亡；而且還可能通過調(diào)節(jié)其體內(nèi)炎性反應(yīng)抑制脾臟及胸腺的caspase-3、caspase-8、caspase-9活性，從而也減少淋巴細(xì)胞凋亡。

綜上所述，右美托咪定對感染性休克大鼠具有減輕炎癥反應(yīng)和改善免疫能力的作用，有利于改善預(yù)后。

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