消瘤平體外誘導(dǎo)人白血病HL-60細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究

詹 飛，李 燦，李瑞生，張玉潔

0 引言

白血病是兒童時期最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率占兒童惡性腫瘤的第一位。急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)約占兒童急性白血病的20%，盡管目前對兒童ALL的療效不斷提高，但仍有20%～30%兒童的ALL出現(xiàn)復(fù)發(fā)且通常復(fù)發(fā)后預(yù)后不良，因此，尋找新的抗腫瘤藥或化療增敏劑，有助于改善AML的療效[1-2]。

消瘤平是由柴胡、炙甘草、黃芩、大棗、法半夏、黨參6味中藥材提取而制成，柴胡和解少陽，疏肝利膽，通達(dá)表里；黃芪、黨參為補中益氣藥，黃芪健脾益氣；法半夏調(diào)和肝胃(脾)，炙甘草調(diào)和諸藥，并提高免疫功能。同時，柴胡歸屬肝經(jīng)，通過調(diào)節(jié)肝經(jīng)的功能以助血滋生[3-4]，因此，消瘤平具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力及抗腫瘤的作用。本研究以人淋巴系白血病細(xì)胞株HL-60為研究對象，觀察消瘤平對該細(xì)胞生長、凋亡及凋亡相關(guān)基因蛋白的影響，以探討消瘤平抗白血病的可能作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 潔凈工作臺(上海凈化設(shè)備廠)；1815TC型CO2培養(yǎng)箱(美國SHEL-LAB產(chǎn)品)；MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Labsystems)；流式細(xì)胞儀FACS Calibur(Becton Dickinson公司)；計算機(jī)數(shù)據(jù)處理軟件CELLQUEST(B.D.公司)；低速離心機(jī)(日本KUBOTA)。

1.2 藥物與試劑 采用水煎法制得消瘤平糖漿劑，HPLC法測得消瘤平中黃芪苷含量為2.32 mg/mL，批號：120315；胎牛血清(德國PAA產(chǎn)品)；RPMI1640培養(yǎng)液(GIBCO產(chǎn)品)常規(guī)溶解，過濾除菌，分裝后4 ℃保存，使用時加入10%胎牛血清、青霉素和鏈酶素各100 mL，5%NaHCO3調(diào)pH值為7.2，即為RPMI1640完全培養(yǎng)液；溴化二甲噻唑二苯四氮(MTT，Sigma 產(chǎn)品)；碘化丙啶(PI，Sigma公司)；Caspase-3、Fas、Bcl-2酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(GDB公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 細(xì)胞株 人白血病細(xì)胞株HL-60細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供，用含20%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人白血病HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3 d傳代1次，取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞用于試驗研究。

2.2 MTT法檢測對人白血病細(xì)胞生長的影響 取處于對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，按常規(guī)制成1×105個/mL細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。將消瘤平溶解于1640培養(yǎng)液中，分別加入96孔培養(yǎng)板，使最終每組含消瘤平濃度分別為：10、20、40、80、160、320 μg/mL，每個濃度設(shè)6個復(fù)孔，空白對照組加等量1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)后24、48、72 h 3個時相各取出1塊96孔板進(jìn)行MTT比色實驗：每次于實驗結(jié)束前從各孔中吸出100 μL上清棄去，加入MTT 10 μL(終濃度5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100 μL終止反應(yīng)，振蕩10 min，使充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長570 nm處測定各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值)×100%”計算細(xì)胞抑制率，以劑量和抑制率繪制生長曲線。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測對細(xì)胞凋亡和周期的影響 將處于對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞以1×106個/mL密度接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的消瘤平和陽性對照藥順鉑，對照組加入等量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置-20 ℃環(huán)境待測相關(guān)基因蛋白；常規(guī)處理細(xì)胞后，用70%預(yù)冷乙醇固定細(xì)胞，置4 ℃環(huán)境中待測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期。檢測前，先離心棄上清，再用PBS洗滌后置于檸檬酸緩沖液中1 h以上，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106個/mL左右，離心棄上清液，加入1 800 μL胰酶消化液，充分作用后加入1 500 μL胰酶抑制酶液(RNASE)，作用數(shù)分鐘后加入1 500 μL碘化丙啶溶液，15 min后用200目尼龍網(wǎng)過濾，采用美國B&D公司流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測細(xì)胞凋亡率并分析細(xì)胞周期。

2.4 ELISA法檢測對凋亡相關(guān)基因蛋白的影響 采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA法)檢測凋亡相關(guān)基因蛋白。取“2.3”中凍存的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按Caspase-3酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復(fù)做對倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對照。待測樣品孔加入裸鼠血清100 μL，將板置37 ℃反應(yīng)120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，用吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，使充分混勻后置37 ℃反應(yīng)60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min，再加入50 μL終止液混勻，酶聯(lián)免疫檢測儀于490 nm處測吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算Caspase-3含量。同法檢測Fas和Bcl-2的含量。

3 結(jié)果

3.1 消瘤平對HL-60細(xì)胞生長的抑制作用 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)消瘤平作用后的細(xì)胞排列稀疏，且隨著作用時間的延長和藥物濃度的增加，細(xì)胞密度逐漸減少。不同濃度組的消瘤平對HL-60細(xì)胞的增殖均有一定的抑制作用，各藥物濃度組細(xì)胞生長抑制率與同時間點對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且隨著作用時間的延長，與同濃度組相比抑制率上升，因此，可見消瘤平體外對HL-60細(xì)胞的生長抑制作用具有濃度和時間依賴性。具體結(jié)果見圖1。

3.2 消瘤平對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 40、80、160 μg/mL消瘤平作用于HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率分別為22.37%、31.25%和53.42%，明顯高于對照組，隨著劑量的增加，細(xì)胞凋亡率明顯增加，并出現(xiàn)凋亡典型性特征峰。結(jié)果見表1。

圖1 消瘤平對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用

表1消瘤平對HL-60細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

注：與細(xì)胞對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

3.3 消瘤平對HL-60細(xì)胞周期的影響 消瘤平作用于細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期均受到不同程度的影響，與對照組相比，3個劑量組G2-M期細(xì)胞比例均增加，高、中劑量組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著藥物劑量的增加，G2-M期的比例也增加；G0-G1期和S期略有減少，但與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。提示消瘤平可通過阻滯G2-M期，從而抑制白血病細(xì)胞的生長，見表2。

表2 消瘤平對HL-60細(xì)胞周期的影響(n=3)

3.4 消瘤平對凋亡相關(guān)基因蛋白Caspase-3、Fas和Bcl-2含量的影響 消瘤平3個劑量均可促進(jìn)Caspase-3蛋白的表達(dá)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；高劑量組Fas蛋白表達(dá)顯著高于對照組，Bcl-2蛋白表達(dá)則明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 消瘤平對HL-60細(xì)胞Caspase-3、Fas和Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

4 討論

急性髓細(xì)胞白血病是一類來源于造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，隨著化學(xué)治療新藥、干細(xì)胞移植與生物療法的開展，急性白血病的治療取得很大進(jìn)步[5-6]。但有一部分患者雖經(jīng)過各種化療藥物治療仍無法完全緩解，或緩解后在短期內(nèi)復(fù)發(fā)，即為難治性白血病。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與機(jī)體的免疫功能(特別是抗腫瘤能力)低下有關(guān)[7]。中藥治療惡性腫瘤，通過扶正祛邪，可增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，減輕患者放療、化療后的臨床癥狀，提高患者術(shù)后生存質(zhì)量，有較明確的抗復(fù)發(fā)效果[8]。因此，國內(nèi)外許多學(xué)者試圖從天然藥物中尋找能有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的藥物或其活性成分用于治療白血病。

腫瘤患者接受化療后，常出現(xiàn)燥熱傷津所致的陰虛內(nèi)熱或氣陰兩虛，治以滋陰潤燥清熱或益氣養(yǎng)陰中藥而取效[9]。消瘤平糖漿劑是由柴胡、炙甘草、黃芪、大棗、法半夏、黨參6味中藥制成，已有研究表明[10]，消瘤平對環(huán)磷酰胺所致免疫功能低下的小鼠有明顯的改善作用，提示其可減輕化療藥物的副作用，在腫瘤輔助治療中具有一定的應(yīng)用前景。本實驗采用MTT法觀察消瘤平對白血病HL-60細(xì)胞生長的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)消瘤平體外可有效殺傷人白血病細(xì)胞HL-60，明顯抑制其增殖，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，且隨著作用時間的延長，抑制作用也增強(qiáng)，提示消瘤平注射液具有明顯的抗白血病活性，作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

腫瘤的發(fā)生不僅與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，還與細(xì)胞的死亡速度減慢有關(guān)，腫瘤發(fā)生的過程必定伴有細(xì)胞凋亡這一主動而有序的細(xì)胞自我消亡過程[11-12]。在正常情況下，細(xì)胞增殖與凋亡保持平衡，當(dāng)細(xì)胞正常增殖和分化被打亂，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖和異常時，就會誘發(fā)疾病。凋亡不僅直接影響機(jī)體組織的正常發(fā)育、分化與死亡，其在腫瘤治療中的作用也受到重視。細(xì)胞周期(Cell cycle)是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從一次分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的整個連續(xù)過程，可分為4個周期：S期、G2期、M期、Gl期。

藥物抗腫瘤作用機(jī)制多與藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。參與細(xì)胞調(diào)控的基因很多，Bcl-2是目前凋亡機(jī)制研究的主要靶分子，是重要的凋亡抑制基因，其表達(dá)升高，細(xì)胞趨向成活。Bcl-2在腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，一方面可以阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，增加惡性細(xì)胞數(shù)量，另一方面可使正常細(xì)胞原癌基因激活，導(dǎo)致細(xì)胞惡性化[13-14]。Caspase蛋白家族處于細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心位置，而Caspase-3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的核心效應(yīng)分子，是最重要的效應(yīng)性蛋白裂解酶，在許多腫瘤中過度表達(dá)，能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生一系列凋亡和生化改變[15]。在出現(xiàn)細(xì)胞受刺激、損傷或接到死亡指令等信號時，Caspase家族被激活，激活的Caspase-3能裂解大量的底物，包括抗凋亡成分及結(jié)構(gòu)或蛋白，并誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。Fas蛋白屬Ⅰ型跨膜蛋白，是腫瘤壞死因子超家族成員，廣泛表達(dá)于人體組織，當(dāng)膜表面Fas蛋白與其配體FasL結(jié)合后，導(dǎo)致Fas空間構(gòu)象改變，引起死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體形成，進(jìn)而激活Caspase家族，啟動蛋白級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。

細(xì)胞凋亡激活信號通路十分復(fù)雜，不同信號分子之間相互聯(lián)系，Bcl-2可抑制Caspase-3激活，從而抑制細(xì)胞凋亡；Bcl-2也是Caspase-3的底物，可被切斷而失去抗凋亡的能力。本研究根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，分別用40、80、160 μg/mL的消瘤平處理細(xì)胞，結(jié)果表明，HL-60細(xì)胞凋亡率與消瘤平濃度呈正相關(guān)，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義；周期變化也與消瘤平的濃度有關(guān)，依次加入不同濃度消瘤平后G2-M%明顯升高，而G0-G1%和S%略有降低。ELISA法檢測結(jié)果顯示，不同濃度消瘤平作用后，HL-60細(xì)胞Caspase-3蛋白表達(dá)隨著藥物濃度的增加有增高趨勢。高濃度還促進(jìn)Fas蛋白的表達(dá)，而Bcl-2蛋白表達(dá)低于對照組。提示消瘤平可能通過將HL-60細(xì)胞阻滯在G2-M期，上調(diào)Caspase-3和Fas蛋白，下調(diào)Bcl-2蛋白，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而達(dá)到抗腫瘤作用，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

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