華蟾素對(duì)人膽管癌細(xì)胞QBC939抑制作用研究

宋艷麗，章 激，曹軍華，吳 倩，張玉潔

0 引言

華蟾素注射液(Cinobutacini injection)是我國(guó)研發(fā)的抗腫瘤中藥制劑，為陰干的中華大蟾蜍皮提取加工而制成，其有效成分總稱為蟾蜍毒素類，具有清熱解毒、利水消腫、化淤潰堅(jiān)等作用[1]，目前已經(jīng)成為我國(guó)臨床上應(yīng)用較為廣泛的抗腫瘤中藥制劑之一。已有的研究表明，華蟾素對(duì)原發(fā)性肝癌、白血病、胰腺癌等效果較好[2-3]，尤其對(duì)消化道腫瘤具有較好的療效。近年來(lái)，隨著對(duì)華蟾素藥理學(xué)研究的進(jìn)一步深入，已分離出其主要活性成分為蟾毒內(nèi)酯類化合物，屬?gòu)?qiáng)心苷類化合物，包括蟾毒靈(Bufalin)、脂蟾蜍配基(Resibufogenin)、華蟾素毒基(又稱華蟾毒精Cinobufagin)等[4]。臨床應(yīng)用以及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，華蟾素及其含有的活性成分對(duì)多種人腫瘤細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，還可促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)分化及提高機(jī)體免疫功能等。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)華蟾素抗腫瘤作用具體機(jī)制的研究尚不深入，并且其對(duì)膽囊癌作用的研究相對(duì)較少。因此，本研究從體內(nèi)和體外觀察華蟾素對(duì)膽囊癌細(xì)胞的抑制作用，及體內(nèi)對(duì)荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影響，以探討其抗膽囊癌的作用及作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和儀器

人膽囊癌QBC939細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院提供；SPF級(jí)BALB/C-nu裸鼠，體重16～20 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，按SPF級(jí)要求管理；華蟾素注射液(安徽金蟾生化股份有限公司，批號(hào)：1204191)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司，批號(hào)：1111031)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；裸鼠細(xì)胞因子酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒(上海森雄科技有限公司)；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將膽囊癌QBC939細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化后按1∶3的比例傳代，每3天傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 MTT法檢測(cè)華蟾素對(duì)人膽囊癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膽囊癌QBC939細(xì)胞，按常規(guī)消化和洗滌后制成密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將溶解于1640培養(yǎng)液的華蟾素注射液分別加入96孔板中，使最終每組含華蟾素濃度分別為10、20、40、80、160、320 μg/mL，每組6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)空白對(duì)照組。置培養(yǎng)箱培養(yǎng)后分別于24、48、72 h 3個(gè)時(shí)相各取出一塊96孔板，先在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，再進(jìn)行MTT比色實(shí)驗(yàn)：每次于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前從各孔中吸出100 μL上清棄去，再加入MTT 10 μL(終濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加入DMSO 100 μL/孔，振蕩5 min，使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)定各孔吸光度值(A)[5]。按照公式計(jì)算不同濃度的華蟾素注射液對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率：抑制率(%)=(陰性對(duì)照孔平均A值-藥物孔平均A值)/陰性對(duì)照孔平均A值×100%，并以劑量和抑制率繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3 制備模型、分組及給藥 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膽囊癌QBC939細(xì)胞制成1×107/mL細(xì)胞懸液。在無(wú)菌條件下，將細(xì)胞懸液接種于BALB/C-nu裸鼠右腋皮下，每鼠接種0.2 mL，約3周待腫瘤生長(zhǎng)至直徑約1 cm左右，以無(wú)菌技術(shù)取出皮下移植瘤。去除包膜和壞死灶，剪成約1 mm瘤塊植入裸鼠的右腋皮下，5～7 d待成瘤后將荷瘤裸鼠隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、5-Fu陽(yáng)性對(duì)照組(25 mg/kg)以及華蟾素注射液(25、50、100 mg/kg)3個(gè)劑量組，每組10只。正常組每日給予生理鹽水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組和華蟾素組均采用腹腔注射的方式給藥，每次0.2 mL，皆連續(xù)給藥12 d。

2.4 檢測(cè)裸鼠一般狀況及進(jìn)食量 給藥期間每日觀察裸鼠的活動(dòng)情況、營(yíng)養(yǎng)狀況和腫瘤生長(zhǎng)情況等，并于給藥第2天和第9天晚上8∶00分別稱取各組飼料的質(zhì)量W1，次日早晨8∶00稱取各組剩余飼料的質(zhì)量W2，計(jì)算裸鼠進(jìn)食量W=W1-W2。

2.5 檢測(cè)抑瘤率 取血后，脫頸椎處死裸鼠，剝?nèi)×鰤K，剔除其他組織后分析天平稱取瘤重量。計(jì)算各組平均瘤塊重量及抑瘤率。腫瘤抑制率(%)=[1-(治療組平均瘤重/陰性對(duì)照組平均瘤重)]×100%。

2.6 檢測(cè)血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1水平 處死裸鼠前，眼眶靜脈叢采血，離心取上清分裝于EP管中。按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)TNF-α的含量。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，每孔加入樣品稀釋液100 μL，第1孔加標(biāo)準(zhǔn)品100 μL，混勻后吸出100 μL移至第2孔。如此反復(fù)做對(duì)倍稀釋至第7孔，最后，從第7孔吸出100 μL棄去，第8孔為空白對(duì)照。待測(cè)樣品孔加入裸鼠血清100 μL，將板置37 ℃反應(yīng)120 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，用吸水紙拍干。每孔加入第一抗體工作液100 μL，使充分混勻后置37 ℃反應(yīng)60 min。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，加入酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)60 min，洗板同前。加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)5～10 min，再加入50 μL終止液混勻，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490 nm處測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算TNF-α含量。本實(shí)驗(yàn)OD值的高低和細(xì)胞因子表達(dá)成正比。同法檢測(cè)并計(jì)算IL-6和sVCAM-1的含量。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞呈圓形，形態(tài)均一，細(xì)胞間連接緊密。經(jīng)過(guò)不同濃度華蟾素作用后的細(xì)胞出現(xiàn)皺縮等形態(tài)學(xué)改變，且隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞密度逐漸減少，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，上述變化更加明顯。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3.2 對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的華蟾素注射液體外均可抑制QBC939細(xì)胞的增殖，各藥物濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與同時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且隨作用時(shí)間的延長(zhǎng)，與同濃度組比較抑制率上升，因此，可見(jiàn)華蟾素注射液體外對(duì)QBC939細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用，這種抑制作用具有濃度和時(shí)間依賴性。見(jiàn)圖2。

圖1 華蟾素注射液對(duì)QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響

3.3 對(duì)荷瘤裸鼠一般狀況及進(jìn)食量的影響 給藥期間觀察荷瘤裸鼠的一般狀況，發(fā)現(xiàn)荷瘤對(duì)照組裸鼠腫瘤增大，并逐漸表現(xiàn)出狀態(tài)欠佳、懶惰、喜靜、活動(dòng)遲緩等癥狀，給藥組裸鼠腫瘤增大趨勢(shì)不及荷瘤對(duì)照組，行動(dòng)同樣遲緩，但活動(dòng)量稍多于荷瘤對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，荷瘤對(duì)照組裸鼠的進(jìn)食量減少，9 d時(shí)更明顯；華蟾素腹腔注射給藥皆可不同程度增加荷瘤裸鼠進(jìn)食量，9 d時(shí)更加明顯，其中高劑量組增加量最多，提示華蟾素可改善裸鼠一般狀況和進(jìn)食量，并具有濃度依賴性，與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 華蟾素注射液體外對(duì)QBC939細(xì)胞增殖的抑制作用

表1 華蟾素注射液對(duì)荷瘤裸鼠進(jìn)食量的影響(n=10)

3.4 對(duì)荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥12 d后，5-Fu(25 mg/kg)可明顯抑制荷瘤裸鼠的瘤質(zhì)量的增長(zhǎng)，與模型組比較具有顯著差異(P<0.001)；華蟾素3個(gè)劑量組(25、50、100 mg/kg)皆可不同程度抑制荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的增加，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，隨著劑量的增加，抑瘤率也增大。見(jiàn)表2。

表2 華蟾素注射液對(duì)荷瘤裸鼠瘤質(zhì)量的影響

3.5 對(duì)荷瘤裸鼠血清IL-6、TNF-α和sVCAM-1含量的影響 與模型組比較，5-Fu(25 mg/kg)能夠提高荷瘤裸鼠血清TNF-α含量(P<0.05)，降低sVCAM-1含量(P<0.01)；高、中劑量的華蟾素組裸鼠血清IL-6水平下降(P<0.05)，TNF-α含量升高(P<0.05)；三個(gè)劑量組的華蟾素均能降低裸鼠血清sVCAM-1含量(P<0.01，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 華蟾素注射液對(duì)荷瘤裸鼠血清IL-6、sVCAM-1和TNF-α含量的影響

4 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤，占消化道惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，膽囊癌發(fā)病隱匿，惡性程度高，早期無(wú)特殊的臨床癥狀。雖然膽囊癌的手術(shù)治療經(jīng)歷了百年多的歷史，但國(guó)內(nèi)外資料表明仍未取得突破性進(jìn)展，療效不盡人意，目前在確診膽囊癌的患者中僅有約30%能獲得根治性切除[6]，除了手術(shù)以外主要的治療方法是放療和化療。由于缺乏特異的癥狀和體征，膽囊癌早期診斷率低，就診的晚期病例難以根治、預(yù)后差。目前的常規(guī)化療藥物對(duì)膽囊癌的治療效果較差，不能提高膽囊癌患者的生活質(zhì)量[7]。因此，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者試圖從天然藥物中尋找能有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞增殖的藥物或其活性成分用于治療膽囊癌。

蟾蜍入藥早在唐宋時(shí)代就有記載，臨床常用于惡瘡、腫瘤、水腫等。華蟾素注射液是以傳統(tǒng)中藥材中華大蟾蜍皮為主要原料制成的一種水溶性制劑，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床[8]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其有一定的抗腫瘤作用，大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)華蟾素注射液是安全、有效的抗腫瘤制劑[9-10]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明，華蟾素及其活性成分蟾毒靈、脂蟾蜍配基等對(duì)白血病、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌等惡性腫瘤均有一定的作用[11-12]，其選擇性作用較強(qiáng)，對(duì)正常組織和細(xì)胞無(wú)殺傷作用，在抗腫瘤治療方面有巨大潛力，但是關(guān)于其作用于膽囊癌細(xì)胞的基礎(chǔ)研究報(bào)道尚少。

裸鼠異種移植瘤模型是人們進(jìn)行腫瘤實(shí)驗(yàn)性治療廣泛采用的研究手段。本研究采用MTT法檢測(cè)華蟾素注射液體外對(duì)人膽囊癌QBC939細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，以及體內(nèi)對(duì)建立的QBC939細(xì)胞裸鼠異種移植瘤行腹腔注射方式給藥，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，華蟾素體內(nèi)外均可有效殺傷人膽囊癌細(xì)胞QBC939，明顯抑制其增殖，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，濃度越高，抑制作用越強(qiáng)，且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也增強(qiáng)；倒置顯微鏡下觀察還發(fā)現(xiàn)，經(jīng)華蟾素處理過(guò)的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)皺縮等形態(tài)學(xué)改變，且隨著濃度和時(shí)間的增加，細(xì)胞密度逐漸減少。提示華蟾素注射液具有明顯的抗膽囊癌活性，且作用呈現(xiàn)劑量依賴性。

IL-6是一種多功能生物活性多肽，可由巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌，也可由腫瘤細(xì)胞旁分泌和自分泌產(chǎn)生。IL-6在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌和乳腺癌等多種惡性疾病中高表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，其高表達(dá)往往提示腫瘤患者一般情況較差，預(yù)后不良[13-14]。TNF-α屬腫瘤壞死因子家族，由單核-巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞分泌，它對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接殺傷作用而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性，在體內(nèi)也可通過(guò)對(duì)腫瘤血管的促凝作用，使腫瘤缺血壞死，還可誘導(dǎo)許多不同來(lái)源腫瘤細(xì)胞凋亡，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的直接殺傷腫瘤作用最強(qiáng)的生物活性因子之一，血中TNF-α含量可反映機(jī)體抗腫瘤免疫狀態(tài)[15-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，華蟾素能抑制裸鼠血清IL-6的表達(dá)，促進(jìn)TNF-α的表達(dá)，作用具有劑量依賴性，與模型組相比，皆具有顯著性差異(P<0.01)，且具有劑量依賴性，這對(duì)防癌、抗癌以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移皆具有重要意義。

sVCAM-1是黏附分子免疫球蛋白超基因家族的成員，可參與多種生理、病理反應(yīng)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，sVCAM-1在多種腫瘤中存在異常表達(dá)，并與腫瘤的惡性臨床表現(xiàn)有一定關(guān)系[17]。在早期或亞臨床期惡性腫瘤患者中，血清sVCAM-1水平異常升高，而將腫瘤進(jìn)行手術(shù)切除以后，sVCAM-1水平可迅速下降[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，華蟾素各濃度均可以抑制裸鼠血清sVCAM-1的表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但是sVCAM-1水平與華蟾素劑量之間的關(guān)系不明顯，說(shuō)明華蟾素對(duì)血清sVCAM-1的影響無(wú)劑量依賴性，還需進(jìn)一步探討。

發(fā)現(xiàn)新型抗腫瘤活性高、毒副作用小的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療領(lǐng)域需要解決的重要任務(wù)。本實(shí)驗(yàn)表明，華蟾素體內(nèi)外均可抑制膽囊癌的生長(zhǎng)，裸鼠體內(nèi)抑瘤作用機(jī)制可能與裸鼠血清IL-6和sVCAM-1等細(xì)胞因子水平下調(diào)及TNF-α水平上調(diào)有關(guān)，這為臨床應(yīng)用華蟾素治療膽囊癌提供了一定的理論依據(jù)，但是機(jī)體腫瘤的形成和發(fā)展過(guò)程極其復(fù)雜，在治療中僅依靠華蟾素難以取得有效的成果，若將其與放化療聯(lián)合使用，能否有效控制膽囊癌生長(zhǎng)，減少耐藥性，值得進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳旭,高波,楊健,等.華蟾素注射液多肽成分體外抗腫瘤活性研究[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2012,47(6):822-826.

[2] 齊芳華,李安源,趙林,等.華蟾素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡及其作用機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(3):318-323.

[3] 朱曉燕,徐立濤,劉魯明,等.華蟾素對(duì)人胰腺癌細(xì)胞BxPC3細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響[J].老年醫(yī)學(xué)與保健,2013,19(1):41-43.

[4] 齊芳華,李安源,趙林華,等.蟾素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡及其作用機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2010,45(3):318-323.

[5] 葉華,鄭學(xué)寶,李立,等.5F對(duì)肝癌細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2012,23(6):1342-1344.

[6] Marsh Rde W,Alonzo M,Bajaj S,et al.Comprehensive review of the diagnosis and treatment of biliary tract cancer 2012.Part I:diagnosis-clinical staging and pathology[J].J Surg Oncol,2012,106(3):332-328.

[7] 石景森,孫學(xué)軍,鄭見(jiàn)寶.原發(fā)性膽囊癌的臨床診治現(xiàn)狀與對(duì)策[J].外科理論與實(shí)踐,2013,18(2):101-103.

[8] 李建昌,柳建軍,凌生濤.華蟾素對(duì)SD大鼠膀胱腫瘤的抑制作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,34(8):726-728.

[9] Qi F,Li A,Inagaki Y,et al.Induction of apoptosis by cinobufacini preparation through mitochondria-and Fasmediated caspase-dependent pathways in human hepatocellular carcinoma cells[J].Food Chem Toxicol,2012,50(2):295-302.

[10]Wang L,Raju U,Milas L,et al.Huachansu,containing cardiac glycosides,enhances radiosensitivity of human lung cancer cells[J].Anticancer Res,2011,31(6):2141-2148.

[11]劉偉.華蟾素誘導(dǎo)L1210細(xì)胞凋亡及作用機(jī)制的研究[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)創(chuàng)新,2012,9(24):16-17.

[12]朱曉燕,盂志強(qiáng),陳震,等.華蟾素不同組分對(duì)荷人胰腺癌SW1990裸小鼠的抑瘤作用[J].上海中醫(yī)藥雜志,2009,43(11):69-71.

[13]Talar-Wojnarowska R,Gasiorowska A,Smolarz B,et al.Clinical significance of interleukin-6 gene polymorphism and IL-6 serllm level in pancreatic adenocarcinoma and chronic pancreatitis[J].Dig Dis Sci,2009,54(3):683.

[14]Paradkar PH,Agashe SV,JoshiJV,et al.Serum IL-6 and micrometry of pap smears in women with cervical low-grade intraepithelial lesions[J].Asian Pac J Cancer Prev,2010,11(4):989-992.

[15]Kruglov AA,Kuchmiy A,Grivennikov SI,et al.Physiological functions of tumor necrosis factor and the consequences of its pathologic overexpression or blockade:Mouse models[J].Cytokine Growth Factor Rev,2008,19(3-4):231-244.

[16]陳學(xué)彰,田華琴,黃志慶,等.肺積方對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤率及EGFR、TNF-α表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合研究,2013,5(1):17-20.

[17]歐陽(yáng)華強(qiáng),謝廣茹,潘戰(zhàn)宇,等.華蟾素對(duì)人胰腺癌CFPAC-l移植瘤裸鼠血清IL-6,IL-8及sVCAM-1表達(dá)的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2011,36(19):2731-2733.

[18]Mantur M,Snarska J,Koper O,et al.Serum sICAM,sVCAM and sE-selectin levels in colorectal cancer patients[J].Folia Histochem Cytobiol,2009,47(4):621.