五味子藥材中木脂素提取工藝優(yōu)選及同時測定其不同產(chǎn)地9種木脂素的含量

崔 妮，王 青，王 瑩，王鵬遠，張?zhí)依?，?宜，王曉娟*

0 引言

五味子是木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實，習(xí)稱“北五味子”。其味酸、甘，性溫,有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心的功能。用于久嗽虛喘、夢遺滑精、遺尿尿頻、久瀉不止、自汗盜汗、津傷口渴、短氣脈虛、內(nèi)熱消渴、心悸失眠等癥[1]。五味子中含有多糖、揮發(fā)油和木脂素類成分[2-3]，其中木脂素類成分與五味子的抗肝臟損傷、抗氧化作用明顯相關(guān)[4]，臨床應(yīng)用較廣泛，但不同產(chǎn)地藥材中木脂素類成分存在一定差異，且文獻報道僅涉及五味子甲素、五味子乙素、五味子醇乙等含量較高成分的含量測定[5-8]，而HPLC同時測定多種木脂素類成分含量測定的方法鮮有報道。本試驗以不同產(chǎn)地五味子為研究對象，對木脂素類成分的提取方法進行優(yōu)選，并建立同時測定其中9種木脂素類成分含量的方法，為五味子藥材的來源鑒別和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

島津LC-2010AHT，LC solution色譜工作站(日本島津公司)；TD51001型電子分析天平(賽多利斯儀器有限公司)；DL-720超聲儀(浙江石浦海天電子儀器廠)。

五味子醇甲、Gomisin D、Gomisin H、五味子醇乙、Gomisin G、Gomisin B、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素(中國科學(xué)院昆明植物研究所，純度均>98%)；五味子藥材采自15個不同產(chǎn)地，分別為黑龍江省的雙城、齊齊哈爾、佳木斯、雞西、雙鴨山，吉林省的公主嶺、四平、白山、通化、延吉，遼寧省的撫順、丹東、鞍山、開原、葫蘆島，以上產(chǎn)地五味子藥材經(jīng)鑒定均為木蘭科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.的干燥成熟果實。甲醇、乙腈(美國Fisher公司)；水為三蒸水(實驗室自制)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18(2) (150 mm×4.6 mm，5 μm)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：235 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL；流動相：甲醇-水梯度洗脫(梯度洗脫程序見表1)。

表1 梯度洗脫程序(%)

2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取對照品五味子醇甲13.90 mg，Gomisin D 2.44 mg，Gomisin H 4.34 mg，五味子醇乙23.44 mg，Gomisin G 2.45 mg，Gomisin B 11.00 mg，五味子甲素11.59 mg，五味子乙素5.15 mg，五味子丙素2.25 mg，加甲醇溶解，并定容至10 mL量瓶中，搖勻，即為對照品儲備液；再精密吸取上述對照品儲備液1 mL至50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，即為含量分別為五味子醇甲 27.80 μg/mL、Gomisin D 4.88 μg/mL、Gomisin H 8.68 μg/mL、五味子醇乙46.88 μg/mL、Gomisin G 4.90 μg/mL、Gomisin B 22.00 μg/mL、五味子甲素23.18 μg/mL、五味子乙素10.30 μg/mL、五味子丙素4.50 μg/mL的混合對照品溶液，搖勻，備用。

2.3 正交試驗與結(jié)果 根據(jù)單因素預(yù)實驗，確定甲醇為提取溶媒，選取影響提取工藝的主要因素溶劑體積A、提取次數(shù)B、提取時間C，進行L9(34)正交設(shè)計試驗，因素水平見表2[9-12]。

表2 因素水平表

以總含量為指標(biāo)，選用L9(34)正交試驗表進行實驗，結(jié)果及方差分析見表3、表4。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析

由極差分析結(jié)果可知，影響木脂素成分提取因素為A>C>B，且溶劑倍數(shù)具有顯著性差異，提取次數(shù)及時間無顯著性差異，對木脂素類成分的提取影響較小。從試驗操作簡便性和成本方面考慮，最終確定決明子中木脂素類成分提取的最佳工藝為A2B3C2，即100倍甲醇超聲提取3次，每次1 h。

取五味子藥材粉末(過三號篩)約0.4 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，按表2設(shè)計的9種工藝進行超聲提取，過濾，合并濾液至100 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按“2.1”項下的色譜條件進行測定，色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品(A)及供試品溶液(B)HPLC圖

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對照品溶液0.4、0.5、2.5、5.0、8.5、10.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制得混合對照品系列液。分別吸取20 μL注入高效液相色譜儀，測定。以各成分的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)、對照品濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程?；旌蠈φ掌酚眉状枷♂尯螅M樣測定，至信噪比分別為10和3時，得各對照品的定量限及檢測限。結(jié)果見表5。

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液，稀釋1.25倍后進樣20 μL，連續(xù)5次，計算色譜峰峰面積RSD，即為日內(nèi)精密度。結(jié)果五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分別為1.97%、1.93%、0.58%、1.95%、2.04%、1.09%、1.05%、1.62%、1.65%；連續(xù)檢測3 d，2次/d，計算色譜峰峰面積RSD，即為日間精密度。結(jié)果五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分別為1.31%、1.61%、1.83%、2.03%、2.12%、2.64%、2.06%、1.81%、0.93%。

表5 9個有效成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、定量限和檢測限

2.6 重復(fù)性試驗 取齊齊哈爾五味子樣品5份，按“2.3”項下分別制備供試品溶液，吸取20 μL進樣，測定峰面積，計算五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分別為2.16%、0.40%、2.29%、1.61%、1.54%、1.84%、0.89%、2.63%、1.41%。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取齊齊哈爾五味子樣品供試品溶液10 μL分別于0、2、4、8、12、24 h進行測定。五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的RSD分別為1.66%、1.34%、0.90%、2.65%、1.54%、1.58%、0.96%、1.33%、1.01%。

2.8 回收率試驗 取已知含量的五味子藥材(齊齊哈爾)粉末6份，每份約0.2 g，精密稱定。分別加適量對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件測定，計算回收率。五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、五味子醇甲、五味子醇乙、Gomisin B、Gomisin D、Gomisin G、Gomisin H的平均回收率分別為99.00%、98.06%、101.36%、98.73%、101.45%、101.65%、98.41%、100.45%、100.05%，RSD分別為2.81%、2.04%、2.42%、2.30%、2.33%、2.74%、2.89%、2.75%、1.82%。見表6。結(jié)果表明，本方法回收率良好。

表6 回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取15個不同產(chǎn)地的五味子藥材約0.4 g，精密稱定，按“2.3”項下方法制備15份供試品溶液，分別吸取對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀中，測定峰面積，計算含量。結(jié)果見表7。

表7 樣品測定結(jié)果(mg/g，n=3)

3 討論

為了確定五味子中9種被測成分的最佳色譜分離條件，分別對流動相、檢測波長、柱溫進行了優(yōu)化。由于樣品中成分較多，等度洗脫無法將所有成分完全分離，所以采用梯度洗脫。筆者比較了甲醇-水、乙腈-水等梯度洗脫條件，發(fā)現(xiàn)甲醇-水即可使各被測成分之間均達到良好的分離，故選其作為流動相進行梯度洗脫。通過對不同柱溫和流速下色譜保留行為的考察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL/min時，分離效果最佳。

為使五味子藥材中的木脂素類成分盡可能提取完全，預(yù)試驗比較了超聲與回流提取對各成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異較小，超聲較為方便，故選擇超聲提取方法，以各種木脂素類成分的總含量為指標(biāo)，進行L9(34)正交試驗。結(jié)果表明，100倍量甲醇超聲提取3次，每次1 h提取效率較高。

預(yù)試驗結(jié)果顯示，五味子樣品中各成分因含量有較大差異，故在正式試驗時，依據(jù)各成分間比例配制混合對照品溶液，使15個不同產(chǎn)地五味子樣品含量均在線性范圍內(nèi)，保證測量的準(zhǔn)確性。

本試驗測定15個不同產(chǎn)地五味子中9種木脂素類成分含量，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地結(jié)果差異較大，其中木脂素類成分以吉林四平最高(22.94 mg/g)，黑龍江雙城較低(12 mg/g)，可能與當(dāng)?shù)氐牡乩砦恢煤蜌夂蛴嘘P(guān)。

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