碘化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法的研究

趙 昕，賀康洪，趙文軍，高 錦

0 引言

碘化鈉注射液為軍隊(duì)醫(yī)院常用制劑，用于腎臟、尿道、膀胱及膽道造影，收載于《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》[1]。該制劑按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法指導(dǎo)原則[2]，屬于應(yīng)建立家兔熱原法或細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的品種，但原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未做規(guī)定。家兔法檢查熱原，成本高、操作復(fù)雜，結(jié)果易受操作人員、試驗(yàn)動物等因素影響，而鱟試劑法檢查注射劑的內(nèi)毒素具有靈敏度高、操作簡便、快速等特點(diǎn)。為保證藥品質(zhì)量，降低使用風(fēng)險(xiǎn)，提高用藥安全性。本文參照2010年版中國藥典附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[3]及文獻(xiàn)[4-6]，建立了鱟試劑方法檢查碘化鈉注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素。

1 藥品與試劑

碘化鈉注射液(規(guī)格：20 mL∶碘化鈉2.5 g、硫代硫酸鈉0.002 g、碳酸氫鈉0.1 g，批號：130724-1、130724-2、130724-3，來源：廣州軍區(qū)某醫(yī)院)；鱟試劑(以下簡稱TAL。規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.25 EU/mL。批號：1309110，生產(chǎn)廠家：湛江博康海洋生物有限公司；批號：1307232，生產(chǎn)廠家：湛江安度斯生物有限公司)；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品(以下簡稱WSE，中國食品藥品檢定研究院，效價(jià)：100 EU/支，批號：150601-201176)；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水(以下簡稱BET水，湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：50 mL，批號：1212260)。

2 方法與結(jié)果

2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值(L)的確定 細(xì)菌內(nèi)毒素限值L=K/M，式中K為人最大可接受的細(xì)菌內(nèi)毒素劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)；M為人用的最大供試品劑量，根據(jù)《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》和本品說明書，得知碘化鈉注射液一次最大用量為50 mL，即 M=50 mL/(60 kg·h)，K為按給藥途徑，人用每公斤體重每小時(shí)可接受的內(nèi)毒素最大劑量，注射劑為5 EU/(kg·h)，按公式計(jì)算得碘化鈉注射液的內(nèi)毒素限值L=6 EU/mL，為嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)、便于計(jì)算，最終確定限值為5 EU/mL。

2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核實(shí)驗(yàn) 按照2010年版中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法規(guī)定，進(jìn)行鱟試劑的標(biāo)示靈敏度復(fù)核，結(jié)果見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核(EU/mL)

2個(gè)廠家的鱟試劑經(jīng)細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品檢查λC在0.5～2.0 λ之間，符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，可用于試驗(yàn)。

2.3 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

2.3.1 供試品最大有效稀釋倍數(shù)(MVD)的計(jì)算 計(jì)算公式為MVD=cL/λ，其中L為碘化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限值5 EU/mL，λ為鱟試劑靈敏度，c為供試品溶液的濃度，當(dāng)L以EU/mL表示時(shí)，則c=1.0 mL/mL。目前市售鱟試劑靈敏度λ通常在0.5～0.03 EU/mL，則碘化鈉注射液的對應(yīng)最大有效稀釋倍數(shù)分別為：MVDλ0.5=10倍；MVDλ 0.25=20倍；MVDλ0.125=40倍；MVDλ0.06=80倍；MVDλ 0.03=160倍。

2.3.2 實(shí)驗(yàn)操作 將碘化鈉注射液用BET水分別稀釋為10、20、40、80、160倍稀釋液，將此系列濃度溶液記為NPC (Negative product control)。另平行制備系列濃度的供試液，并使10、20、40、80、160倍稀釋液的供試液中均含有2 λ濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素，將此系列溶液記為PPC(Positive product control)。用來自2個(gè)廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑，分別與上述PPC和NPC兩種溶液進(jìn)行反應(yīng)，每一濃度重復(fù)兩管，并設(shè)陽性對照(Positive control)和陰性對照(Negative control)，分別記為PC和NC，混勻后封口，置37 ℃恒溫容器中反應(yīng)60 min，結(jié)果見表2。

表2 碘化鈉注射液干擾預(yù)試驗(yàn)

干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，用2個(gè)廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑分別對3批碘化鈉注射液行細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)，結(jié)果碘化鈉注射液的10、20、40、80、160倍稀釋液均無干擾。

2.4 正式干擾試驗(yàn) 為了最終確認(rèn)是否存在抑制因素的影響，進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)。取3批碘化鈉注射液用BET水分別稀釋為20倍稀釋液，用該20倍稀釋液和BET水分別將WSE稀釋為含內(nèi)毒素0.5(2 λ)、0.25(λ)、0.125(0.5 λ)、0.06 (0.25 λ) EU/mL的溶液，與2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑反應(yīng)，每一濃度重復(fù)4管，并設(shè)陰性對照，按2010年版中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試品干擾試驗(yàn)項(xiàng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 碘化鈉注射液的干擾試驗(yàn)(EU/mL)

正式干擾試驗(yàn)結(jié)果表明，將3批次碘化鈉注射液稀釋20倍，用2個(gè)廠家靈敏度均為0.25 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果ES均在0.5～2.0 λ，Et均在0.5～2.0 ES范圍內(nèi)，符合藥典規(guī)定，確認(rèn)供試液對檢查無干擾影響。

2.5 樣品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 按2010年版中國藥典細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，將3批次碘化鈉注射液(用BET水配成20倍稀釋液)，用2個(gè)廠家靈敏度λ均為0.25 EU/mL的鱟試劑，按《中國藥典》(二部)附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法檢查，結(jié)果見表4。

表4 碘化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

3 討論

3.1 碘化鈉注射液pH值范圍為7.0～9.0，符合細(xì)菌內(nèi)毒素檢查供試液pH值要求標(biāo)準(zhǔn)，不干擾凝膠反應(yīng)，無需調(diào)節(jié)可直接取供試品用BET水稀釋后檢查。

3.2 將碘化鈉注射液配制成10、20、40、80、160倍稀釋液，與2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑反應(yīng)均無干擾。正式干擾試驗(yàn)，將樣品稀釋20倍，用2個(gè)廠家靈敏度為0.25 EU/mL的鱟試劑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果ES均在0.5～2.0 λ，Et均在0.5～2.0 ES范圍內(nèi)，確認(rèn)無干擾影響。對3批次碘化鈉注射液分別依法檢查，結(jié)果均符合規(guī)定。

3.3 取本品，依法檢查(《中國藥典》2010年版附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法)，每1 mL碘化鈉注射液中含內(nèi)毒素應(yīng)<5 EU/mL。

參考文獻(xiàn)：

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