金銀花-山銀花水提液不同配比體外抗氧化作用研究

田 磊，蔣寶平，何 苗，李 申，樊曉峰*

0 引言

金銀花作為常用中藥材，具有清熱解毒、涼散風(fēng)寒的功效?！吨袊?guó)藥典》2000年版及之前版本將金銀花和山銀花作為一個(gè)品種收載，2005年版和2010年版將其分開(kāi)收載[1]。金銀花為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花；山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq.、華南忍冬L.confusaDC.或黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[2]。金銀花和山銀花都含有黃酮類和有機(jī)酸類成分，具有清除人體超氧離子自由基的作用，在抗衰老、改善血管功能與提高機(jī)體免疫力等方面均具有重要作用[3]，但金銀花較山銀花昂貴。因此，能否用山銀花代替金銀花，或者兩者混合使用是否能實(shí)現(xiàn)單用金銀花的效果是臨床關(guān)注的問(wèn)題，目前，二者以不同的配比合用之后抗氧化作用如何變化，未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究選擇金銀花和山銀花水提液的不同配比(1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1)，比較金銀花和山銀花水提液合用后體外抗氧化作用，為合理應(yīng)用金銀花和山銀花提供一定的依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑 中藥金銀花、山銀花購(gòu)自亳州市豪門中藥飲片有限公司，金銀花經(jīng)鑒定為忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花，山銀花經(jīng)鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。

鹽酸(上海中試化工總公司，批號(hào)：20100913)，鄰苯三酚(遵義林源醫(yī)藥化工有限責(zé)任公司，批號(hào)：101120)，水楊酸(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20100804)，無(wú)水乙醇(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：11031410288)，硫酸亞鐵(上海久億化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20100108)，雙氧水(成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20110114)，DPPH (ALDRICH公司，批號(hào)：D913-2)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(Hyclone，批號(hào)：NWCO387)，胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)：100517)，雙抗(青霉素—鏈霉素，GiBCO，USA，批號(hào)：15140)，噻唑藍(lán)(MTT，Amresco，批號(hào)：0793)，二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO，Sigma，批號(hào)：D5879)，胰蛋白酶(Trypsin，USA，Sigma，批號(hào)：27250018)，PBS粉末(福州邁新恒武技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司，批號(hào)：11030202Y)。乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20110625)，一氧化氮(NO)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20110625)，微量丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：20110625)。

1.2 細(xì)胞株 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECS)，南京凱基生物技術(shù)發(fā)展有限公司。

1.3 儀器 JA-1203電子天平：上海天平儀器廠；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；AY120型分析天平：Shimadzu corporation，Japan；酶標(biāo)儀：SPECTRA MAX190型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀，Molecular Devices；CHK-213倒置顯微鏡，OLYMPUS；5% CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)orma311，USA；ELS-10T生命科學(xué)型超純水機(jī)，南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

2 方法

2.1 藥品的提取 金銀花和山銀花的水提液采用文獻(xiàn)方法[4]提取。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，將金銀花與山銀花水提液按照1∶0、2∶1、1∶1、1∶2、0∶1混合制成混合液，并按實(shí)驗(yàn)要求配制成所需濃度。

2.2 抗氧化活性篩選方法

2.2.1 DPPH·自由基清除率的測(cè)定[5]配制濃度為0.1 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，待測(cè)樣品以無(wú)水乙醇溶解并稀釋成不同濃度的溶液。按以下計(jì)算公式中的方法加樣，室溫下反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)定吸光值。每樣重復(fù)3次，取平均值，按下式計(jì)算自由基清除率：K= [1-(Ai-Aj)/Ac]×100%，式中Ai為2 mL DPPH溶液加2 mL待測(cè)溶液的吸光值；Aj為2 mL待測(cè)溶液加2 mL乙醇的吸光值；Ac為2 mL DPPH溶液加2 mL乙醇的吸光值。

2.2.2 羥自由基(·OH)清除率的測(cè)定[6]在試管中依次加9 mmol/L水楊酸—乙醇溶液0.5 mL，0.5 mL不同濃度的待測(cè)樣品，9 mmol/L Fe2+溶液(現(xiàn)配)0.5 mL，3.5 mL蒸餾水，最后加入8.8 mmol/L H2O25 mL啟動(dòng)Fenton反應(yīng)，37 ℃反應(yīng)30 min，搖勻后于510 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。每樣重復(fù)3次，取平均值，下列公式計(jì)算羥自由基的清除率：K=[1-(A1-A2)/A3]×100%。式中A1為加入9 mmol/L Fe2+溶液測(cè)得的吸光值；A2為以0.5 mL 蒸餾水代替9 mmol/L Fe2+溶液測(cè)得的吸光值；A3為0.5 mL蒸餾水代替待測(cè)樣品測(cè)得的吸光值。

2.2.3 超氧陰離子(O2-·)清除率的測(cè)定[6]采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用。取10 mmol/L PBS緩沖液4.5 mL (pH 8.3)與100 μL不同濃度的待測(cè)樣品混合，于25 ℃恒溫15 min，取混合液3 mL加入45 mmol/L 鄰苯三酚100 μL，搖勻，反應(yīng)3 min后于420 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。每樣重復(fù)3次，取平均值，按下式計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率：K= [1-(A1-A2)/A3]×100%，式中A1為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL待測(cè)樣品，加100 μL鄰苯三酚溶液的吸光值；A2為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL10 mmol/L HCl加100 μL蒸餾水的吸光值；A3為4.5 mL PBS緩沖液加100 μL鄰苯三酚加100 μL蒸餾水的吸光值。

2.2.4 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和過(guò)氧化氫造模濃度篩選[7]HUVECs按照常規(guī)方法培養(yǎng)，取細(xì)胞濃度為1×105/mL，接種于96孔板，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層融合后，棄去上清，加入不同濃度的過(guò)氧化氫使其終濃度為300、200、150、100、50 μmol/L，空白對(duì)照組不加任何溶液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入終濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h后棄去MTT溶液，每孔加入200 μL DMSO后室溫振搖10 min，使結(jié)晶充分溶解。選擇490 nm，在酶標(biāo)儀上測(cè)定每孔的吸光值。按抑制率公式，計(jì)算H2O2對(duì)HUVECs細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。生長(zhǎng)抑制率(%)=(空白組OD-給藥組OD)/(空白組OD-調(diào)零孔OD值)×100%。

2.2.5 藥物對(duì)HUVECs上清中LDH、NO含量的影響[8]將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/mL，接種于24孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿單層融合后棄去上清，以含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h，使其同步化生長(zhǎng)用于試驗(yàn)。分組：空白對(duì)照組，用無(wú)血清的1640培養(yǎng)液；模型組，無(wú)血清的培養(yǎng)液+60 μmol/L H2O2作用12 h；不同濃度樣品組，加入含有不同濃度樣品的培養(yǎng)液預(yù)孵2 h后，換為含有60 μmol/L H2O2的培養(yǎng)液作用12 h，收集培養(yǎng)液試劑盒檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 金銀花-山銀花水提液不同配比清除DPPH·自由基的能力 金銀花-山銀花水提液不同配比均具有清除DPPH·自由基的能力，其不同配比清除DPPH·的IC50值分別為10.41、5.68、6.18、20.99、4.28 mg/mL。根據(jù)IC50值的大小，金銀花-山銀花不同配比清除DPPH·自由基的能力大小順序?yàn)椋?∶1>2∶1>1∶1>1∶0>1∶2。見(jiàn)圖1。

3.2 金銀花-山銀花水提液不同配比清除羥自由基(·OH)的能力 通過(guò)Fenton反應(yīng)體系產(chǎn)生·OH，可以測(cè)定各提取液對(duì)·OH的清除能力。由于藥液帶有顏色，為了排除藥液本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，濃度控制在250 mg/mL范圍內(nèi)。本研究結(jié)果表明，金銀花-山銀花不同配比均具有清除·OH的能力，其不同配比在濃度允許范圍內(nèi)清除·OH能夠達(dá)到的最大抑制率的順序依次為：2∶1>0∶1>1∶1>1∶2>1∶0。見(jiàn)圖2。

圖1 不同配比清除DPPH·自由基的能力

圖2 不同配比清除羥自由基的能力

3.3 金銀花-山銀花水提液不同配比清除超氧陰離子(O2-·)的能力 本研究采用硝基四氮唑藍(lán)還原法，通過(guò)檢測(cè)吸光度的變化確定提取物清除O2-·的能力大小。由于藥液帶有顏色，為了排除藥液本身對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾，將濃度控制在250 mg/mL范圍內(nèi)。結(jié)果顯示，金銀花-山銀花不同配比均具有清除O2-·的能力，其不同配比在濃度允許的范圍內(nèi)清除O2-·能夠達(dá)到的最大抑制率的順序依次為：1∶0>2∶1>1∶1>1∶2>0∶1。見(jiàn)圖3。

圖3 不同配比清除超氧陰離子的能力

3.4 金銀花-山銀花水提液不同配比對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷的影響

3.4.1 H2O2濃度的篩選 計(jì)算不同濃度的H2O2對(duì)HUVECs細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率并計(jì)算半數(shù)抑制率后，將H2O2濃度最終確立為60 μmol/L，見(jiàn)表1。

表1 不同濃度H2O2對(duì)HUVECs細(xì)胞增殖抑制率的影響

3.4.2 金銀花-山銀花水提液不同配比對(duì)H2O2誘導(dǎo)HUVECs細(xì)胞損傷的影響 H2O2損傷后，模型組細(xì)胞活力明顯下降，不同濃度藥物干預(yù)后，細(xì)胞H2O2的損傷程度較模型組低。H2O2損傷后，模型組細(xì)胞LDH釋放量明顯增加，不同濃度藥物干預(yù)后可明顯減少HUVECs細(xì)胞釋放LDH。H2O2損傷后，模型組細(xì)胞上清中NO含量減少，藥物干預(yù)后使細(xì)胞上清中NO含量增加。各指標(biāo)結(jié)果綜合顯示，金銀花-山銀花水提液能夠?qū)笻2O2誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞損傷，作用強(qiáng)弱依次為：1∶0>2∶1>1∶2>1∶1>0∶1。見(jiàn)表2。

表2 金銀花-山銀花水提液不同配比對(duì)抑制HUVEC細(xì)胞H2O2損傷的作用及對(duì)細(xì)胞中LDH和NO的影響(n=3)

4 討論

1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH·)有單電子，在517 nm處有強(qiáng)吸收，其醇溶液呈紫色的特性。當(dāng)有自由基清除劑存在時(shí)，由于與其單電子配對(duì)而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，所以，可用分光光度計(jì)進(jìn)行快速的定量分析。超氧陰離子自由基(O2-·)、羥基自由基(·OH)等活性氧自由基是在機(jī)體代謝過(guò)程中產(chǎn)生的。在某些病理情況下，許多疾病，如動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病、中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、糖尿病、癌癥及肝臟的化學(xué)毒性反應(yīng)、衰老、休克、炎癥等病理過(guò)程的發(fā)生都直接或間接與自由基的損傷有關(guān)[9-11]。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，金銀花-山銀花水提液不同配比各劑量組均具有抗氧化作用，其中金銀花-山銀花2∶1組綜合效果最佳。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能與心血管的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。H2O2是經(jīng)典的氧化劑，可使多種細(xì)胞氧化損傷，促進(jìn)羥自由基的產(chǎn)生，誘導(dǎo)細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用60 μmol/L H2O2作用于HUVECs細(xì)胞，細(xì)胞活力明顯下降，金銀花-山銀花不同配比組干預(yù)后可以明顯抑制H2O2的損傷，抑制效果以金銀花-山銀花1∶0組最強(qiáng)，2∶1組次之。LDH反映細(xì)胞膜完整性和細(xì)胞收到損傷與死亡程度[12]。內(nèi)皮細(xì)胞合成的NO是一種內(nèi)源性抗氧化劑，能抑制多種凋亡刺激因素引起的細(xì)胞損傷[13]。本研究結(jié)果顯示，金銀花-山銀花不同配比能夠使受損細(xì)胞NO的含量增加、LDH釋放減少，其中金銀花-山銀花1∶0組作用最強(qiáng)，2∶1組次之。

綜上所述，金銀花-山銀花不同配比均有一定的抗氧化作用，尤其是金銀花-山銀花2∶1配比體外抗自由基、抗氧化及保護(hù)H2O2損傷的HUVECs細(xì)胞的作用最佳，為金銀花及山銀花的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010,28:205.

[2] 王芳,蔣躍平,王曉良,等.金銀花的化學(xué)成分研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(9):1378-1385.

[3] 王芳,高松.金銀花、山銀花藥理學(xué)研究現(xiàn)狀[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,15(4):237-239.

[4] 高紅寧.微濾-超濾法精制金銀花水提液[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2011,10(17):54-55.

[5] 陳瀚,李進(jìn),李祥,等.板藍(lán)根不同提取部位的體外抗氧化活性[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2012,18(9):184-186.

[6] 陳莉,肖永成,林晶.刺山柑果實(shí)醇提取物的體外抗氧化活性[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,20(5):44-46.

[7] Zhai L,Zhang P,Sun RY,et al.Cytoprotective effects of CSTMP a novel stilbene derivative against H2O2 induced oxidative stress in human endothelial cells[J].Pharmacol Rep,2011,63(6):1469-1480.

[8] 王曉斌,于鋒,劉飛.丹酚酸B對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].東南大學(xué)學(xué)報(bào),2008,27(1):42-46.

[9] 黃美艷,唐于平,尚爾鑫,等.當(dāng)歸-川芎藥對(duì)不同制法與配對(duì)抗氧化活性相互作用研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,32(8):234-238.

[10]朱玲娜,唐麗琴.糖尿病腎病中氧化應(yīng)激對(duì)炎癥細(xì)胞因子的影響[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(9):1226-1229.

[11]Lagouge M,Larsson NG.The role of mitochondrial DNA mutations and free radicals in disease and ageing[J].J Intern Med,2013,273(6):529-543.

[12]Ren C,Bao YR,Meng XS,et al.Comparison of the protective effects of ferulic acid and its drug-containing plasma on primary cultured neonatal rat cardiomyocytes with hypoxia/reoxygenation injury[J].Pharmacogn Mag,2013,9(35):202-209.

[13]黃波,陳暢.NO的功能及其作用機(jī)制[J].生物物理學(xué)報(bào),2012,28(3):173-184.