生物鐘基因period3的多態(tài)性及其與睡眠關(guān)系的研究進(jìn)展

安懷杰，鄭巍薇，史成和，吳成林，孫 濤*，趙曉航#

(海軍總醫(yī)院航海航空醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100048;* 通訊作者，E-mail:drsuntao1@163.com;#共同通訊作者，E-mail:xhztao@126.com)

睡眠為維持正常生理活動所必需。人類的睡眠活動受到一系列因素綜合調(diào)節(jié)，包括外界因素和機(jī)體自身調(diào)節(jié)機(jī)制。外界因素包括光照、溫度等;機(jī)體自身的調(diào)節(jié)則包括兩個相對獨(dú)立又互相聯(lián)系的調(diào)節(jié)機(jī)制，即晝夜節(jié)律和睡眠平衡。本文主要是對晝夜節(jié)律生物鐘核心環(huán)路基因per3的多態(tài)性及其與睡眠關(guān)系的研究進(jìn)展。

1 晝夜節(jié)律與生物鐘核心環(huán)路

晝夜節(jié)律，又稱近日節(jié)律，是周期約為24 h的生理過程;即使在缺乏外界因素的條件下，如光照和溫度等，晝夜節(jié)律仍能維持原有的生理周期［1］。從光合原核生物到高等真核生物，晝夜節(jié)律廣泛存在。晝夜節(jié)律的標(biāo)志是機(jī)體核心溫度和血漿中皮質(zhì)醇和褪黑素的水平。哺乳動物生物鐘的調(diào)節(jié)中樞位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nuclei，SCN)，通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)，使大腦與全身各個部位的節(jié)律趨于一致［2］。

在分子水平，晝夜節(jié)律是通過高度保守的轉(zhuǎn)錄水平反饋環(huán)路進(jìn)行調(diào)控的，因此轉(zhuǎn)錄因子在晝夜節(jié)律調(diào)控方面發(fā)揮了重要的作用。晝夜節(jié)律的核心基因包括 clock、bmal1、npas2、per1－3 和 cry1－2。轉(zhuǎn)錄激活因子BMAL1與CLOCK都具有bHLH－PAS結(jié)構(gòu)，二者能形成異二聚體結(jié)合在靶基因啟動子區(qū)域的順式元件E－box上，從而啟動靶基因轉(zhuǎn)錄。二者的靶基因包括:period(在哺乳動物中，包括per1－3)和crytochrome(包括cry1和cry2)，以及占轉(zhuǎn)錄總量約8%－10%的“時鐘控制基因”(clock－controlled genes，CCGs)。細(xì)胞質(zhì)中的PER蛋白與CRY蛋白能形成異源復(fù)合體，并轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核中，與BMAL1－CLOCK蛋白復(fù)合體相互作用，進(jìn)而抑制轉(zhuǎn)錄過程的進(jìn)行;當(dāng)PER－CRY蛋白復(fù)合體逐步降解后，BMAL1－CLOCK蛋白復(fù)合體逐步恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性，從而形成負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。在轉(zhuǎn)錄水平以外，這一環(huán)路同時還受到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)節(jié)。一系列蛋白激酶以及蛋白酶體降解機(jī)制，包括E3連接酶和FBXL3，這些都能通過調(diào)節(jié)PERs/CRYs在mRNA和蛋白水平的穩(wěn)定性，使PERs/CRYs的蛋白水平和細(xì)胞定位發(fā)生周期性變化，從而影響晝夜節(jié)律的周期。在負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路和多種次級調(diào)節(jié)環(huán)路的綜合作用下，晝夜節(jié)律的周期維持在約24 h［3］。

2 per3基因與晝夜節(jié)律

per家族基因是生物鐘調(diào)節(jié)的核心基因。1971年，Konopka和Benzer首次報道在果蠅中發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)節(jié)律的基因，命名為period基因［4］;而后在小鼠和人類中也發(fā)現(xiàn)了相似的基因。在哺乳動物中，per家族基因包括per1、per2和per3。利用基因敲除小鼠模型研究功能時發(fā)現(xiàn)，在per1、per2、cry1和cry2這四個基因中，僅存在任意一個基因即可以維持晝夜節(jié)律;與此相對，在per1/per2雙敲除小鼠模型中，僅per3蛋白存在不足以維持晝夜節(jié)律。同時per3－/－小鼠的晝夜節(jié)律相關(guān)標(biāo)志與野生型小鼠相比較并沒有明顯變化［5］。因此認(rèn)為，per3并不是晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)中的核心成分，其在晝夜節(jié)律形成中的作用機(jī)制并未明確。

隨著對per3功能研究的深入，人們逐步了解其在晝夜節(jié)律中的作用。由于前期對生物節(jié)律的研究集中在依賴于視交叉上核的行為以及對光線的反應(yīng)，盡管視交叉上核是控制哺乳動物自身節(jié)律的中樞，但其并非唯一具有自身節(jié)律的器官，腎上腺、肝臟、視網(wǎng)膜在體外均表現(xiàn)出自身節(jié)律［6－8］。Pendergast等利用per1－Luc的報告系統(tǒng)在體外檢測不同器官的自身節(jié)律時發(fā)現(xiàn)，雖然在檢測由視交叉上核控制的運(yùn)動活力時per3－/－小鼠與野生小鼠沒有顯著差別;但是PER3蛋白失去功能時，小鼠的下丘腦和肺的自身節(jié)律出現(xiàn)變化，提示PER3可能參與其他器官自身節(jié)律的調(diào)節(jié)［9］。該課題組進(jìn)一步利用per2－Luc報告基因系統(tǒng)，在體內(nèi)進(jìn)一步證實(shí)per3對視交叉上核、腎臟、胸腺、弓狀體和脾等器官的自身節(jié)律沒有顯著影響，但在per3失活后，小鼠的垂體、肝、腎、食管和主動脈的自身周期縮短。提示per3對不同器官的節(jié)律存在不同的調(diào)節(jié)作用［8］。

3 per3對睡眠的影響

睡眠穩(wěn)態(tài)平衡是調(diào)節(jié)睡眠的另一個重要因素。最初對睡眠平衡的研究來自于睡眠剝奪現(xiàn)象的觀察:在睡眠剝奪后，機(jī)體需要的睡眠增加以進(jìn)行補(bǔ)償，從而形成一種平衡機(jī)制。睡眠平衡的標(biāo)志是腦電圖(electroencephalogram，EEG)的 Delta波活動(delta activity)或慢波睡眠活動，檢測腦電圖Delta波活動可以評估維持睡眠平衡的需要程度［10］。維持睡眠平衡的分子基礎(chǔ)仍未明確。

Hasan等［11］報道，per3參與睡眠－清醒時間以及睡眠平衡的調(diào)節(jié)。利用per3基因敲除小鼠作為研究模型，發(fā)現(xiàn)在暗周期時對小鼠進(jìn)行睡眠干擾，野生型小鼠的運(yùn)動活力顯著下降，而per3－/－小鼠運(yùn)動活力的下降程度顯著低于野生型小鼠，與npas2－/－小鼠的表型相類似。在以24 h為周期的基準(zhǔn)水平上，per3－/－小鼠與野生型小鼠沒有顯著差別，但在暗周期中per3－/－小鼠的快速動眼期睡眠(rapid eye movement Sleep，REM)時間減少;在暗周期開始和結(jié)束時per3－/－小鼠表現(xiàn)出更高的EEG Delta波活動。睡眠剝奪(sleep deprivation，SD)后，per3－/－小鼠表現(xiàn)出更高的非快速動眼期睡眠(non-rapid eye movement sleep，non-REM)的需求，EEG的Delta波活動升高;與此相對，在睡眠剝奪后的恢復(fù)期，代表REM的Theta波活動降低。這表明雖然per3不是晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的核心組分，但其通過參與清醒活力與睡眠平衡的調(diào)節(jié)，進(jìn)一步對機(jī)體睡眠產(chǎn)生影響。

per3表達(dá)變化對人類睡眠的影響亦有報道。與年輕人相比較，大部分老年人的入睡和清醒時間更早，較難維持睡眠并且更容易受到環(huán)境的影響。Hida等［12］研究了老年人外周單核細(xì)胞中per1、per2和per3表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，與年輕人(8個不同群體人群，平均年齡21歲)的表達(dá)水平相比較，老年人(6個不同群體人群，平均年齡62歲)的外周單核細(xì)胞中per1和per2的表達(dá)沒有顯著變化;而per3的表達(dá)則出現(xiàn)變化:per3表達(dá)達(dá)到谷值的時間提前，而達(dá)到峰值的時間則延遲。同時研究結(jié)果顯示，老年人褪黑素分泌周期略有提前，提示per3表達(dá)的變化可能與老年人下降的睡眠動力(homostatic sleep drive)有關(guān)。

4 per3基因多態(tài)性研究進(jìn)展

人類的per3基因位于染色體1p36，基因長60 475 bp，mRNA長6 203 bp，共編碼1201個氨基酸，共21個外顯子。在第18個外顯子區(qū)域存在4個或5個串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)，每個VNTR編碼18個氨基酸。這一區(qū)域存在一系列預(yù)測的磷酸化位點(diǎn)，因此per3基因的VNTR多態(tài)性與人日常的晝行偏好、大腦皮質(zhì)區(qū)活力以及認(rèn)知水平等相關(guān)。根據(jù)per3等位基因VNTR的數(shù)目，人類存在per34/4(具有4個VNTR)，和per35/5(具有5個VNTR)兩種純合個體，以及per34/5的雜合個體。

不同人群中per3 VNTR分布頻率不盡相同。Nadkarni等［13］統(tǒng)計(jì)了全球范圍內(nèi)不同人群的per34等位基因的分布頻率，北非及西亞、南亞地區(qū)(阿爾及利亞、北蘇丹、也門、印度)的頻率最低，為0.5至0.6;東亞地區(qū)(蒙古、中國四川、日本)的頻率最高，為0.8 至 0.9。Ciarleglio 等［14］選取全球范圍內(nèi)，非裔美國人、歐裔美國人、非洲加納、中國漢族、巴布亞新幾內(nèi)亞五個不同人群的樣本，分析clock、per2、per3等節(jié)律基因多態(tài)性的分布情況時發(fā)現(xiàn)，中國漢族樣本中per34等位基因分布頻率最高，為0.81，其余組樣本分布頻率介于0.41至0.66之間，提示中國人群per3 VNTR分布與其他族群有顯著不同。安懷杰等［15］鑒定了漢族人群中，per34/4、per34/5、per35/5三種基因型分布頻率分別為78.33%、20%和1.67%，表明漢族人大多數(shù)基因型為per34/4。

4.1 per3 VNTR多態(tài)性對睡眠生理及晝夜偏好的影響

前期研究表明，per3 VNTR影響個人晝夜偏好:per35/5健康個體有日行偏好，入睡等待時間較短;per34/4健康個體則有夜行偏好，入睡等待時間較長，與睡眠延遲綜合征(delayed sleep phase syndrome，DSPS)相關(guān)［16］。在正常生理狀態(tài)下與per34/4個體相比，per35/5個體具有更多的慢波睡眠(slow wave sleep，SWS)與在非快眼動睡眠(non-REM)期間腦電圖(EEG)的慢波睡眠活動(slow wave activity，SWA);在清醒狀態(tài)和快眼動睡眠(REM)期間的Theta波和Alpha波活動也有增加［17］。

已有不同研究組報道per3 VNTR多態(tài)性與個人晝夜偏好的關(guān)系。睡眠情況會隨著年齡增長有所改變，與年輕人相比，老年人清醒時間和次數(shù)延長、慢波睡眠時間較少，以及清醒時間提早。Viola等比較不同per3基因型老年人的睡眠差異時發(fā)現(xiàn)，per35/5純合子褪黑素周期提前，并且更早到達(dá)褪黑素分泌頂點(diǎn);同時夜間更易清醒，在快速動眼期睡眠時腦電波Delta活動增加，前Sigma活動降低［18］。這些結(jié)果表明老年人群的晝夜節(jié)律和睡眠平衡同時受到per3 VNTR多態(tài)性調(diào)節(jié)。Kunorozva等［19］則研究了非洲職業(yè)運(yùn)動員中per3 VNTR和晝夜偏好的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在自行車和跑步兩類運(yùn)動員中，日行偏好的比例均高于普通人對照組，同時per35等位基因頻率也更高，運(yùn)動員的時間偏好與per3 VNTR多態(tài)性存在顯著關(guān)聯(lián)。有研究調(diào)查了432個挪威高校學(xué)生個體per3 VNTR數(shù)目與晝夜偏好的關(guān)系，但沒有發(fā)現(xiàn)兩者存在關(guān)聯(lián)，提示晝夜偏好可能受到多種因素的綜合影響［20］。

4.2 per3 VNTR多態(tài)性對失眠的影響

對不同基因型的健康志愿者進(jìn)行睡眠剝奪實(shí)驗(yàn)后檢測腦電圖，在睡眠剝奪后清醒時期，per35/5個體Sigma和Alpha活動上升更為迅速，REM睡眠和覺醒時期Alpha活動顯著增高。睡眠缺乏是現(xiàn)代社會普遍存在的現(xiàn)象，對睡眠平衡和認(rèn)知能力的影響顯著。在長期部分睡眠不足的情況下，per35/5個體呈現(xiàn)出更高的慢波睡眠活力、更高的睡眠平衡壓力，因此有更高的睡眠需求;但在認(rèn)知能力、執(zhí)行能力和主觀睡意方面則與per34/4個體沒有顯著區(qū)別［21］。另一項(xiàng)共19個志愿者參與的小樣本研究中，研究者們通過評價心理警覺、客觀警覺、主觀睡意幾個方面，發(fā)現(xiàn)per34/4個體在睡眠受限制(sleep restriction，SR)的情況下表現(xiàn)出更高的彈性;該研究結(jié)果提示per3可能在睡眠限制的情況下參與機(jī)體自身穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)［22］。

相當(dāng)一部分(36%－91%)酒精依賴者面臨失眠的困擾，嗜酒者常表現(xiàn)出夜行偏好。因此Brower等［23］調(diào)查了酒精依賴者中失眠與per3 VNTR的關(guān)系。分別問卷調(diào)查了失眠程度、人格特點(diǎn)、精神狀態(tài)、童年受虐情況、酒精成癮情況，并分析per3 VNTR基因型，以研究per3 VNTR是否對酒精成癮者的失眠情況存在影響。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在酒精依賴者中，飲酒多少、身體與精神的健康程度，均與失眠嚴(yán)重程度有關(guān)。值得注意的是，該調(diào)查發(fā)現(xiàn)，基因型為per34/4的酒精依賴者比per35/5依賴者具有更嚴(yán)重的失眠評分，提示在控制其他相關(guān)因素的前提下，per3 VNTR有助于預(yù)測酒精依賴者的失眠程度。

4.3 per3 SNP多態(tài)性與睡眠偏好

per3 VNTR多態(tài)性與睡眠的關(guān)系已被許多課題組證明。然而，基因多態(tài)性并不局限于VNTR多態(tài)性，還存在其他基因水平的可遺傳變異，如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)。SNP是一種常見的可遺傳變異，指在基因水平上發(fā)生單個核苷酸的變異引起的DNA序列的多態(tài)性。SNP可能導(dǎo)致基因翻譯產(chǎn)物的成分、構(gòu)象等發(fā)生改變，從而可能導(dǎo)致不同的生物學(xué)結(jié)果。SNP的分布具有特異性，不同人的SNP分布不盡相同。Gu等［24］通過對1 250個高加索人進(jìn)行全基因組掃描，評價了約250萬個SNP位點(diǎn)與人體晨間血液中褪黑素水平的關(guān)系，得到20個候選基因上1 298個候選SNP位點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn)，per3與血清中褪黑素水平存在顯著關(guān)聯(lián);在最為顯著的SNP位點(diǎn)(SNP1－7763877 G＞T)，血清褪黑素水平下降達(dá)到28%。Ojeda等［25］通過對209個大學(xué)生篩查基因組SNP，同時問卷調(diào)查其睡眠情況后統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，per3基因的一個非同義突變，rs2640909，與晝夜偏好有關(guān)。研究結(jié)合分析晨間復(fù)合尺度調(diào)查(composite scale of morningness，CSM)和SNP檢測發(fā)現(xiàn)，rs2640909與CSM中的子量表“晨間活動”密切相關(guān);第一次發(fā)現(xiàn)這一SNP與晝夜習(xí)性存在關(guān)聯(lián)。

4.4 per3 VNTR對光照敏感性的影響

光對人類行為、警覺以及認(rèn)知存在影響;除了可見光以外，不可見光對人的生理活動也存在調(diào)節(jié)作用。人類對不可見光的敏感程度與光的波長有關(guān)，對短波長的藍(lán)光(460－480 nm)尤為敏感，如在生理周期的夜晚時期，藍(lán)光(460 nm)能顯著抑制褪黑素分泌從而影響睡眠。Vandewalle等研究發(fā)現(xiàn)，攜帶不同per3VNTR長度的人群對光的反應(yīng)程度不同。藍(lán)光照射能引起丘腦枕部位和大腦皮質(zhì)前額、旁側(cè)的反應(yīng)增加，但不同等位基因型之間的反應(yīng)時間不同:per35/5出現(xiàn)在睡眠缺乏時期，而per34/4出現(xiàn)在剛?cè)胨瘯r期;提示per3的VNTR多態(tài)性在對藍(lán)光刺激的反應(yīng)存在時相差異［26］。在另一項(xiàng)研究中，受試者經(jīng)歷1.5 h弱光，2 h完全黑暗，2 h藍(lán)光照射，最后經(jīng)歷45 min的弱光恢復(fù)期，并檢測受試者褪黑素水平等相關(guān)指標(biāo)。Chellappa等［27］發(fā)現(xiàn)，在接收光強(qiáng)度為6 500 K的藍(lán)光照射后，per35/5純合子夜間褪黑素上升的水平顯著下降，而per34/4純合子則沒有顯著影響。同時，per35/5純合子表現(xiàn)出更強(qiáng)的警覺性;腦電圖Theta波活動程度是推測睡意程度的一個標(biāo)志，清醒狀態(tài)腦電圖顯示，per35/5純合子Theta波活動與per34/4純合子相比顯著減弱。這一研究結(jié)果提示，per35/5純合子對藍(lán)光反應(yīng)更為敏感。

5 展望

Per3作為晝夜節(jié)律基因中的一員，曾被認(rèn)為不是晝夜節(jié)律的核心組分;但隨著對per3研究的深入，它的功能逐步得到闡明，與睡眠之間的關(guān)系逐漸明確。關(guān)于per3的認(rèn)識仍存在許多盲區(qū)，如per3在晝夜節(jié)律和睡眠平衡兩個過程中的作用，是否扮演橋梁角色，它進(jìn)行調(diào)節(jié)的分子機(jī)制又是如何，這些都需要進(jìn)一步探索研究。

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