小型吸蟲成蟲永久性玻片標本制作技術(shù)

戴婷婷，周本江，王 紅，張偉琴，郭艷梅

(1山西醫(yī)科大學汾陽學院病原生物與免疫學教研室，汾陽032200;2昆明醫(yī)科大學病原生物學系;3昆明醫(yī)科大學海源學院人體寄生蟲學教研室)

醫(yī)學寄生蟲學在我國是醫(yī)藥衛(wèi)生院校學生必修的一門基礎(chǔ)醫(yī)學課程，屬于形態(tài)學的范疇。實驗教學是形態(tài)學科的重要組成部分，實驗課的主要內(nèi)容就是如何把采集到的大體標本制作成能夠長期保存和使用的永久性玻片標本。對寄生蟲標本進行辨識是醫(yī)學生培養(yǎng)的重要內(nèi)容，它將為寄生蟲病的診斷、寄生蟲病的防治以及寄生蟲學的科學研究打下堅實的基礎(chǔ)［1］。故寄生蟲學實驗標本的制作和保存具有重要意義。

寄生于人體的吸蟲成蟲是寄生蟲學實驗課中必須觀察的重要標本。制作的成蟲玻片標本要求能夠顯示其自然狀態(tài)下難以觀察到的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征是寄生蟲學實驗技術(shù)難題。傳統(tǒng)的標本固定、染色、脫水、透明和封片目前仍是吸蟲成蟲玻片標本的常規(guī)制作方法［2，3］。本實驗在常規(guī)寄生蟲永久性玻片標本制作的基礎(chǔ)上，摸索出了并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲染色標本制作的理想條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蟲體來源 并殖吸蟲活體成蟲自實驗動物模型家貓的肺臟或胸腔獲得，華支睪吸蟲活體成蟲獲自家貓的肝膽管內(nèi)。

1.1.2 主要試劑及其配制 勞氏(Looss)固定液(氯化汞飽和水溶液100 ml，冰醋酸2－4 ml);鹽酸卡紅染液(卡紅粉 4 g，鹽酸 2 ml，蒸餾水15 ml，85%乙醇95 ml);1%鹽酸乙醇(70%乙醇99 ml，濃鹽酸1 ml);3%碘液、梯度乙醇(35%－100%)、二甲苯、中性樹膠。

1.1.3 主要儀器 生物體視鏡(XTT型實體顯微鏡)、光學顯微鏡(2XA850883)。

1.2 方法

將取自實驗動物模型的活體成蟲置于37℃無菌生理鹽水中存放5－10 h，使其子宮內(nèi)的部分蟲卵和消化管中的黑色殘留物排出，便于收集蟲卵和減少雜質(zhì)對封片標本的影響［4］。小型吸蟲成蟲玻片標本的制作步驟如下。

1.2.1 固定 ①壓平:取載玻片和蓋玻片各一張，在載玻片中央滴加清水，將蟲體自盛有生理鹽水的培養(yǎng)皿內(nèi)移至載玻片上，平放在清水中并擺正位置(腹吸盤居中)。將蓋玻片輕輕覆蓋在蟲體表面，用解剖針緩慢輕壓，并不斷調(diào)整蟲體姿態(tài)，待蟲體充分伸展、厚薄適宜、口腹吸盤位置正常、內(nèi)部主要結(jié)構(gòu)顯現(xiàn)為止。②固定:用濾紙片吸干載玻片上多余的水分，從蓋玻片邊緣緩慢滴入2－3滴勞氏液，并根據(jù)需要適時補充固定液，蟲體自外緣向中心逐漸發(fā)白，待整條蟲體完全變白且失去伸縮性后，輕輕移開蓋玻片，將初步固定的蟲體轉(zhuǎn)入凹皿內(nèi)，再滴加少量的勞氏液繼續(xù)固定1－2 h。③終止固定:吸棄勞氏液，用蒸餾水清洗2－3遍。④適應等滲:依次用35%、50%、70%的梯度乙醇浸泡各30 min后，再換一次70%的乙醇。⑤脫汞:在70%乙醇浸泡蟲體的凹皿中滴加2－3滴3%的碘液，用滴管吹打均勻，使其成濃茶色即可，留置1－2 d且間歇吹打。⑥脫碘:吸棄碘液，加入70%乙醇洗脫去碘，液體若為茶色，勤換乙醇，輕輕反復吹打，注意千萬不能傷及蟲體，待蟲體顏色完全變白為止。保存在70%乙醇中以備染色。

1.2.2 染色 ①染色:將壓平固定、脫汞脫碘處理后的蟲體自70%乙醇保存液中移入平皿內(nèi)，加入鹽酸卡紅染液以淹沒蟲體為宜，浸染時間分2，4，6 h 3個組別。②脫色:將染液中的蟲體標本移入70%乙醇中沖洗數(shù)次，并用滴管不斷沖洗蟲體直至沒有染液析出為止。③分色:將脫色后的蟲體移入1%鹽酸乙醇中分色，做2，6，10 min的分組試驗。分色過程必須在體視顯微鏡進行，需要密切觀察分色的程度。④沖洗:將分色后的標本移入70%乙醇中換洗2次，并用滴管不斷沖洗蟲體?？蓵簳r保存在80%的乙醇中以備制片。

1.2.3 脫水 把蟲體組織內(nèi)水分逐漸脫凈，以便透明和封片。將蟲體依次移至80%，85%，90%，95%和無水乙醇內(nèi)進行梯度脫水，分20，30，40 min三個組別，可隨濃度的升高而適當縮短脫水的時間。

1.2.4 透明 將經(jīng)無水乙醇脫水后的蟲體移入二甲苯中透明，分20，25，30 min三個組別。

1.2.5 封片 封片前根據(jù)蟲體大小選擇適宜規(guī)格的蓋玻片。取經(jīng)清潔液處理過的潔凈載玻片，在其中1/3與右1/3交界處滴加中性樹膠(用二甲苯溶解稀釋到適宜的黏稠度)2－3滴，將透明滿意的蟲體從透明液中取出后，迅速從一側(cè)插入樹膠中(盡量縮短與空氣接觸的時間，否則蟲體會因吸水而發(fā)白)，擺正體位使腹面向上、頭端朝下，待樹膠浸過蟲體，然后用小鑷子夾取潔凈的蓋玻片，由左側(cè)徐徐蓋下，即基本完成制片過程。如樹膠中有較大的氣泡，可用解剖針輕輕挑去，然后平放在防塵托盤內(nèi)，保存在通風、避光、防震、防潮處或干燥箱內(nèi)干燥，經(jīng)鑒定后在玻片的左1/3處貼上記錄標簽，標注名稱(學名和中文名)及蟲齡等重要信息。

圖1 并殖吸蟲成蟲口吸盤和卵黃腺Figure 1 Oral sucker and vitellaria of Paragonimus

圖2 并殖吸蟲成蟲腹吸盤和腸支Figure 2 Ventral sucker and intestinal branches of Paragonimus

圖3 并殖吸蟲黑褐色的子宮內(nèi)充滿蟲卵Figure 3 Uterus of Paragonimus(full of eggs)

圖4 并殖吸蟲一對睪丸Figure 4 A pair of testes of Paragonimus

圖5 華支睪吸蟲成蟲染色標本Figure 5 Adult worm stained samples of Clonorchis sinensis

圖6 華支睪吸蟲腹吸盤、子宮內(nèi)充滿蟲卵Figure 6 Ventral sucker and uterus of Clonorchis sinensis

圖7 華支睪吸蟲的卵巢、受精囊、睪丸Figure 7 Ovary，spermatheca and testes of Clonorchissinensis

2 結(jié)果

2.1 標本處理

對染色、分色、脫水和透明時間等步驟分別進行分組試驗處理標本，經(jīng)過摸索發(fā)現(xiàn)，染色時間2－4 h為宜，蟲體內(nèi)部器官呈現(xiàn)深紅色。分色時間為6 min時，蟲體內(nèi)各組織器官色差明顯、層次清晰，此時蟲體外表面為淺玫瑰紅色。脫水時間不宜過短，30 min最佳，可將組織內(nèi)的水分脫凈。透明時間30 min為宜，不可過長，待整體完全透明、內(nèi)臟器官清晰可見即可封片。

2.2 結(jié)構(gòu)觀察

本實驗技術(shù)制作的標本有以下特征:

2.2.1 標本可清晰地看到并殖吸蟲成蟲的口吸盤呈淺紅色，卵黃腺呈現(xiàn)深紅色，腺組織發(fā)達，分布于蟲體的兩側(cè)、背面及腹面的兩外側(cè)，由口吸盤后緣起直至蟲體末端(圖1，見第549頁)。腹吸盤亦為淺紅色和鮮紅色的兩側(cè)腸支。腸支在食道后分為兩支，經(jīng)3－4個波浪狀彎曲伸達蟲體亞末端(圖2，見第549頁)。

2.2.2 標本可見并殖吸蟲成蟲的子宮團深紅色，龐大而明顯，子宮管蟠曲成團，內(nèi)含大量黑褐色蟲卵呈顆粒狀，密布于子宮內(nèi)部(圖3，見第550頁)。2個睪丸玫紅色，左右并列于蟲體后1/3處，位于腸支之間。睪丸中心體較小，呈長形分葉狀，分葉長短粗細不一，分3－5葉，分葉末端常有膨大(圖4，見第550頁)。

2.2.3 華支睪吸蟲成蟲蟲體半透明、狹長、扁平，狀似葵花籽，前端較窄，后端鈍圓(圖5，見第550頁)。雌性生殖器官有1個分葉狀的卵巢呈玫紅色，受精囊淡紅色、橢圓形，位于卵巢的斜后方。棕色子宮位于卵巢與淡粉色的腹吸盤之間，其內(nèi)充滿黑褐色蟲卵。雄性生殖器官有1對紫紅色分支狀睪丸，前后排列在蟲體后1/3處。棕黃色的卵黃腺濾泡狀，分布于蟲體中段兩側(cè)(圖6、7，見第550頁)。

3 討論

小型吸蟲，如并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲的永久性玻片標本的制作過程一般包括固定、染色、脫水、透明和封片五個主要步驟，各步驟間環(huán)環(huán)相扣，任何一個環(huán)節(jié)被疏忽都會影響到整個標本的制作效果。固定的目的是防止生物標本的組織細胞自溶或腐敗，是制作標本最基礎(chǔ)的一步。標本固定應選擇活的成蟲，死亡后固定效果差，并且會影響到后面的染色。本實驗選擇勞氏液固定蟲體，是基于冰乙酸有克服單純固定液容易引起蟲體收縮的作用，勞氏液可凝固蛋白質(zhì)，也可較好地固定胞質(zhì)和胞核，并可使蟲體充分伸展［5］。

染色是標本制作的重要環(huán)節(jié)，決定著標本的質(zhì)量。最佳效果是經(jīng)過染色后的蟲體不同部位、不同組織間呈現(xiàn)出一定的色差，這樣才有利于觀察寄生蟲的形態(tài)和結(jié)構(gòu)［6］。標本染色后必須使用脫水劑將組織內(nèi)的水分脫盡，才有利于組織的透明和玻片標本的保存。否則，寄生蟲組織內(nèi)的水分能分解組織、阻止透明劑的滲入和油溶性的封片劑混合。脫水是從低濃度乙醇到高濃度乙醇逐級進行，緩慢地將組織內(nèi)的水分吸出，反之易引起組織強烈的收縮而變形，直接影響到生物標本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和形態(tài)，不利于標本的觀察和鑒定。但高濃度乙醇很容易使染好的標本變脆，故浸泡時間不宜太長。標本經(jīng)脫水后體內(nèi)仍可能存在一些雜質(zhì)，會影響到光線的穿透。必須放置在透明劑(二甲苯)中透明，通過改變標本的折光率，從而使更多的光線能夠透過組織，便于顯微觀察和封片永久保存。封片是標本制作的最后一道工序，需要使用封固劑。封固劑一般使用加拿大樹膠或中性樹膠(neutral balsam)，后者為國產(chǎn)天然樹膠，淺黃色透明液體，一般購置后即可使用。若過于黏稠可加入適量的二甲苯稀釋，過稀時打開瓶蓋放置在37℃烤箱中一定時間即可。中性樹膠不溶于水，干燥后形成無色透明固體，牢固地黏附在蓋玻片與載玻片之間，能夠隔絕被封固的標本與外界空氣接觸，避免標本受潮、干裂和被氧化而褪色，蟲體不會出現(xiàn)收縮變形等現(xiàn)象，有利于標本長期保存。

吸蟲標本制作質(zhì)量的好壞亦與工作經(jīng)驗有著很大的關(guān)系。具體到不同蟲種，其實際操作步驟有所不同［7］。標本制作方法關(guān)鍵在于:①標本固定過程中壓得越平整其細微結(jié)構(gòu)越清晰，但切勿壓破。至于是否加壓固定視蟲體大小厚薄而定，并殖吸蟲和華支睪吸蟲的成蟲個體較小，只需輕壓成形即可。②染色及分色依蟲體大小與厚薄而定，并殖吸蟲成蟲比華支睪吸蟲厚，則染色和分色的時間稍長。分色結(jié)果決定著染色的成敗，分色要恰到好處，顏色不能過深也不能過淺，要在生物體視鏡下密切觀察，一直分到各內(nèi)臟器官色度適宜為止。③脫水必須充分徹底，時間視標本的大小厚薄而定。如果水分不能完全脫盡，則不易透明，若在封片時的透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象，需重復脫水。蟲體脫水后較硬易碎，最好用小勺移動蟲體，并且一定要輕拿輕放，否則易損壞蟲體結(jié)構(gòu)，令制片過程夭折。④透明時間30 min即可，時間太長標本變得很脆，不易封片。⑤封片時中性樹膠的量要恰到好處，過多影響美觀，過少易產(chǎn)生氣泡，且使蟲體與空氣接觸而發(fā)白。操作時，將蓋玻片稍傾斜使其一側(cè)先與樹膠接觸，再緩慢地將其放下，盡量減少或避免氣泡產(chǎn)生。若樹膠液不足以覆滿標本，可從蓋玻片邊緣補充，但需要注意避免蟲體移位。一般標本與蓋玻片四邊的距離約為2 mm，太靠邊緣標本易受空氣中酸的作用而褪色，甚至損壞。

高質(zhì)量的標本用于教學，學生容易在顯微鏡下觀察到蟲體內(nèi)部的細微結(jié)構(gòu)，能使理論教學與實驗觀察有機地結(jié)合起來，不僅減輕了帶教老師的工作強度，還能有效地提高實驗教學課的教學效果。本實驗標本的制作技術(shù)對傳統(tǒng)的制作方法進行了改進，通過對染色、分色、脫水和透明時間等步驟分別進行分組試驗處理，摸索出了小型吸蟲成蟲永久性玻片標本制作的最佳條件，是理想的寄生蟲學教學標本和科研標本制作的實驗技術(shù)。運用本方法制作的并殖吸蟲、華支睪吸蟲成蟲玻片標本形態(tài)逼真、色澤鮮艷、內(nèi)部結(jié)構(gòu)清晰、組織器官層次分明、長期保持不褪色。不僅能夠延長保存時間，而且能夠顯示出其自然狀態(tài)下的重要形態(tài)結(jié)構(gòu)，如吸盤、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)特征清晰可見，是鑒定寄生蟲蟲種的重要基礎(chǔ)［8，9］。

［1］趙輝元.家畜寄生蟲與防制學［M］.長春:吉林科學技術(shù)出版社，1996:7.

［2］World Health Organization.Basic Laboratory methodsin medical Parasitology［M］.Geneva:World Health Organisation，1991:1－122.

［3］陳興保，吳觀陵，孫新，等.現(xiàn)代寄生蟲病學［M］.北京:人民軍醫(yī)出版社，2002:1－3.

［4］沈一平.實用肺吸蟲病學［M］.2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:231－232.

［5］李朝品.人體寄生蟲學實驗研究技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:7－13.

［6］Chen PH，Kong DF，Li HZ，etal.The experimental technique of human parasitology［M］.Beijing:Scientific Publishers，1988:9－17.

［7］肖芳萍.不同保存期吸蟲標本胭脂紅染色時間的比較［J］.中國獸醫(yī)科技，2002，32(7):41－42.

［8］陳佩惠，孔德芳，李慧珠，等.人體寄生蟲學實驗技術(shù)［M］.北京:科學出版社，1988:6－7.

［9］堵南山.無脊椎動物玻片標本制作法［M］.上海:上海科學技術(shù)出版社，1961:36－81.