三種分色方法制作旋毛蟲肌幼蟲囊包染色標(biāo)本的效果觀察

閆鈺鑫，蔡 歡，樊 航，張 澎， 楊沛文，常 遠(yuǎn)，陳文輝， 王國(guó)英

1.河南大學(xué) 民生學(xué)院，河南 開封 475004； 2.河南大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004

旋毛形線蟲(Trichinellaspiralis)簡(jiǎn)稱旋毛蟲，是旋毛蟲病的病原體，其所引起的旋毛蟲病是人獸共患寄生蟲病，對(duì)人體危害大，嚴(yán)重感染時(shí)能致人死亡。旋毛蟲幼蟲寄生在宿主橫紋肌細(xì)胞內(nèi)，形成幼蟲囊包，在活檢的肌肉中查到旋毛蟲幼蟲囊包是確診旋毛蟲病的病原診斷依據(jù)[1]。因此，旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本的制作對(duì)于旋毛蟲病臨床診斷和人體寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)具有重要意義。

旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本的制作，有不染色和染色兩種方法[2-3]。通常采用染色法，常規(guī)染色一般用一種染料，為單染。在標(biāo)本制作中, 分色作為控制染色效果的重要步驟尤為重要。本實(shí)驗(yàn)用三種分色方法對(duì)旋毛蟲肌幼蟲囊包染色標(biāo)本進(jìn)行處理，取得較好的效果，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

固定液：甲醛6mL， 體積分?jǐn)?shù)95%乙醇20mL，冰醋酸1mL，蒸餾水40mL混合均勻。染色液(醋酸明礬卡紅染色液)[4]： 鉀明礬(硫酸鋁鉀)4g，卡紅2g，蒸餾水50mL，冰醋酸 5mL。將明礬溶于水中煮沸，加入卡紅繼續(xù)煮沸5min，以玻棒攪拌至卡紅溶解為止，冷卻后置于棕色瓶中放于窗口，陽光下暴曬2～7d后過濾，再加入冰醋酸。分色液：體積分?jǐn)?shù)2%的鹽酸乙醇，鹽酸2mL，無水乙醇 98mL。

1.2 標(biāo)本采集與制片

旋毛蟲蟲種為本實(shí)驗(yàn)室引自河南省疾病預(yù)防控制中心，用小白鼠傳代保種的旋毛蟲(Trichinellaspiralis)。10 只昆明小鼠， 體質(zhì)量(18～22)g， 雌性， 購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。每鼠感染100條肌幼蟲，感染300d后小鼠引頸處死，取完整隔肌和部分腹肌(10mm×10mm)，生理鹽水清洗陽性鼠肉，放入4 ℃冰箱2h，然后分別剪成小塊，置于兩張載玻片之間, 擠壓后兩端用線扎緊，制成制片。

1.3 固定與染色

制片置于固定液中24h，解線后再固定1h，流水沖洗5min，蒸餾水沖洗5min。然后置于染色液中24h，取出后蒸餾水沖洗至標(biāo)本不脫色為止(約5min)。

1.4 分色

1.4.1 分色方法1 染色后的制片依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%的乙醇中脫水，各30min； 體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精分色8～13min；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水30min。無水乙醇∶二甲苯(1∶1)混合液中透明30min，加純二甲苯30s。載玻片上滴加中性樹膠，制片放入，加蓋玻片，平置標(biāo)本盒內(nèi)，室溫陰干。

1.4.2 分色方法2 染色后的制片入體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精分色3min，依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%的乙醇中脫水，各30min； 體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精再分色6～10min；體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水30min。透明與封片步驟同分色方法1 。

1.4.3 分色方法3 染色后的制片入體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精分色8～13min，依次放入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%、100%的乙醇中脫水，各30min。透明與封片步驟同分色方法1 。

2 結(jié)果

2.1 分色方法1制作的標(biāo)本

圖1A鏡下觀察，囊包橢圓形，囊壁薄，與周圍組織能夠區(qū)分；囊內(nèi)分兩層，內(nèi)層較厚，著色較深，呈深紫紅色，幼蟲淡染蜷曲于內(nèi)層之中，外層較內(nèi)層薄，著色較淺，呈淺紫紅色,囊包結(jié)構(gòu)清晰。圖1B鏡下觀察，囊包圓形，囊壁薄，囊的內(nèi)層較厚，外層較薄，幼蟲淡染蜷曲于內(nèi)層。內(nèi)、外層分界明顯，囊包結(jié)構(gòu)清晰。

2.2 分色方法2制作的標(biāo)本

圖1C鏡下觀察，囊包橢圓形，囊壁薄似一細(xì)線，呈深紫紅色，與周圍組織分界明顯，輪廓清晰；囊內(nèi)分兩層，外層著色較淺，呈淺紫紅色，內(nèi)層著色較深，呈深紫紅色，緊裹幼蟲，形狀呈橢圓形，幼蟲淡染半透明狀，蜷曲于內(nèi)層之中，囊包結(jié)構(gòu)清晰。圖1D鏡下觀察，囊包橢圓形，囊壁薄，囊的內(nèi)層較厚，形狀近似圓形，幼蟲淡染蜷曲于內(nèi)層，外層較薄。內(nèi)、外層分界明顯，囊包結(jié)構(gòu)清晰。

2.3 分色方法3制作的標(biāo)本

圖1E鏡下觀察，囊包近似圓形，囊壁薄呈深紫紅色，與周圍組織有明顯分界，結(jié)構(gòu)清晰。囊內(nèi)分兩層，外層較薄，著色較淺，呈淺紫紅色；內(nèi)層呈圓形，著色較深，呈深紫紅色，緊裹幼蟲，幼蟲淡染蜷曲其中。

圖1F鏡下觀察，囊包橢圓形，囊壁薄，囊的內(nèi)層較厚，形狀橢圓形，呈深紫紅色，幼蟲淡染蜷曲其中，外層著色較淺，呈淺紫紅色。內(nèi)、外層分界明顯，囊包結(jié)構(gòu)清晰。

圖1 旋毛蟲感染300 d染色標(biāo)本(400×)A：分色方法1；B：分色方法1；C：分色方法2；D：分色方法2；E：分色方法3；F：分色方法3

3 討論

醋酸明礬卡紅染色液染色后，旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本，呈暗深紫紅色，囊包與周圍組織著色相同，不易觀察，必須經(jīng)過分色，囊包、囊內(nèi)幼蟲及周圍組織色澤顯示出較大差別，囊包層次分明的典型特征才能清晰觀察。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， 三種分色方法各有特點(diǎn)。

分色方法1 的特點(diǎn)：先脫水后分色。染色后的制片經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%的乙醇脫水，然后入分色液中分色，再經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水。分色前，染片沒有脫色現(xiàn)象發(fā)生，參與脫水的各不同梯度乙醇基本保持原有無色。由于分色是一次完成，要注意控制分色效果，避免分色后標(biāo)本色澤過深或過淺的狀況。此種分色方法制作的標(biāo)本色澤稍偏暗。

分色方法2 的特點(diǎn)：兩次分色。染色后的制片入體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精第一次分色，入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%的乙醇脫水，再入體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精第二次分色，然后入體積分?jǐn)?shù)為100%的乙醇脫水。其脫水過程伴隨兩次分色。第一次分色，由于時(shí)間只有3min，這時(shí)制片色澤暗深，幼蟲囊包結(jié)構(gòu)不易觀察；第二次分色，是控制色澤的重點(diǎn)階段。分色過程中，細(xì)心觀察制片的脫色情況，發(fā)現(xiàn)制片有染色較深的點(diǎn)狀物，其周圍的色澤稍淺，說明分色基本完成，可將制片置于鏡下，觀察幼蟲囊包的結(jié)構(gòu)，確定分色效果。此種分色方法制作的標(biāo)本色澤稍偏亮，幼蟲淡染半透明狀。

分色方法3 的特點(diǎn)：先分色后脫水，是常用的分色方法[5]。染色后的制片入體積分?jǐn)?shù)為2%的鹽酸酒精分色后，加入體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、80%、95%、100%的乙醇脫水。由于是先分色后脫水，且分色是一次完成，注意分色時(shí)，染片的色澤要保持稍深，因?yàn)樵诓煌荻纫掖嫉拿撍^程中，染片會(huì)繼續(xù)輕微脫色而導(dǎo)致色澤逐漸變淺。特別在經(jīng)體積分?jǐn)?shù)50%和70%的乙醇時(shí)，可使原有的無色變?yōu)闇\粉色，脫色還是較為明顯的。此種分色方法制作的標(biāo)本色澤稍偏鮮艷。

三種分色方法的分色時(shí)間均不固定，在一個(gè)變動(dòng)的范圍，因?yàn)槿旧珪r(shí)間一定的條件下，壓片厚薄、取材部位均能對(duì)染色產(chǎn)生影響。壓片薄的染片，脫色稍快，分色時(shí)間要適當(dāng)縮短，壓片厚的染片，脫色相對(duì)較慢，分色時(shí)間要適當(dāng)延長(zhǎng)；取材腹肌的壓片脫色稍快，取材膈肌的壓片脫色相對(duì)稍慢。因此，在實(shí)際操作中，分色時(shí)間要視具體情況而定。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制作旋毛蟲肌幼蟲囊包染色標(biāo)本，作為控制染色效果重要步驟的分色，既可以采用分色方法1的先脫水后分色，也可以采用分色方法2 的脫水過程伴隨兩次分色，還可以采用分色方法3 的先分色后脫水，關(guān)鍵是分色時(shí)間要掌握恰當(dāng)，才能得到較好的分色效果。

經(jīng)過三種分色方法處理的旋毛蟲肌幼蟲囊包染色標(biāo)本，鏡下觀察，囊包結(jié)構(gòu)均清晰可見，均可滿足臨床診斷和實(shí)驗(yàn)教學(xué)需要。

[1] 詹希美.人體寄生蟲學(xué)[M].5版. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：216-219.

[2] 羅新萍，王愛華.旋毛蟲肌幼蟲囊包不染色標(biāo)本的制作[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，2003，21(4)：241.

[3] 陳瑩，楊曉燕，鄭煥欽，等.三種旋毛蟲肌肉期幼蟲染色方法的比較研究[J]. 熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2010 ，10(1)：9-10.

[4] 陳佩惠, 孔德芳, 李惠珠, 等.人體寄生蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京: 科學(xué)出版社, 1988. 15.

[5] 李丹，楊丁，皮本偉，等 .旋毛蟲肌幼蟲囊包標(biāo)本的復(fù)染制作方法[J].中國(guó)寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志， 2012，30 (2)： 164.