PPARγ與重組腺病毒載體

李瓊 （綜述），黃起壬 （審校）

（1.南昌大學藥學院藥理教研室，南昌 330006；2.江西護理職業(yè)技術學院護理系，南昌 330052）

基因免疫和治療是將外源目的基因轉移到機體內，表達具有生物學功能的蛋白，達到免疫預防或治療的目的。病毒載體是常用的基因導入方式之一，而腺病毒載體由于轉基因效率高，不受靶細胞是否為分裂細胞所限，容易制得高滴度病毒載體，且生物活性評價較簡便，在基因治療和免疫方面有了越來越多的應用。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPARs）超家族成員之一——PPARγ可促進脂肪細胞分化，調節(jié)脂肪細胞信號傳導，在脂肪代謝中起到重要作用。本文就PPARγ、腺病毒載體的結構與特點及重組腺病毒載體在PPARγ研究中的應用綜述如下。

1 PPARγ的結構與特點

PPARs是一類由配體激活的核轉錄因子，屬于Ⅱ型核受體超家族。目前已發(fā)現由3種亞型，即α、β、γ 組成，分別含有 468，441 和 497 個氨基酸殘基［1］?？膳c9-順-視黃酸受體（retinoid X receptor，RXR）形成異二聚體，與輔阻遏蛋白結合，抑制靶基因表達。當受到PPARγ配體和 （或）RXR配體激活后，PPAR/RXR構象發(fā)生改變并與輔激活蛋白結合，共同結合到靶基因的PPARγ反應元件（PPREs），從而調控靶基因的表達。另外，PPARγ也能在配體依賴方式下通過抑制其他轉錄因子如NF-κB及活化劑蛋白-1（AP-1）家族從而直接地抑制促炎癥基因的表達［2-3］。 人類的 PPARγ 基因有 4 種亞型：PPARγ1，PPARγ2，PPARγ3，PPARγ4。上述 4 種亞型的基因基本相同。由于PPARγ1和PPARγ3擁有同一個轉錄起始點，故PPARγ1和PPARγ3 mRNA產生相同的蛋白產物-PPARγ1。相反PPARγ2在外顯子A2和外顯子1有一個γ2-絕對編碼外顯子，從而使得PPARγ2蛋白比 PPARγ1和 PPARγ3多 30個 N端氨基酸［4］。PPARγ4 和 PPARγ1、PPARγ3 一樣都編碼PPARγ1蛋白，對于它目前所知甚少。PPARγ1在脂肪組織、脾臟、外周血淋巴細胞、肝臟及骨骼肌中均有表達；PPARγ2在脂肪組織中高水平表達，而在骨骼肌僅有低水平表達；PPARγ3的表達僅限定在巨噬細胞和大腸。各亞型組織分布的不同，在體內發(fā)揮的作用及影響因素不同。

PPARγ配體有內源性和外源性配體，內源性配體如花生四烯酸、LTB4、15d-PGJ2、前列腺素 A1、前列腺素D2等，外源性配體如TZDs、吲哚美辛、血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑（sartans）和WY-14643、ETYA等。PPARγ通過調節(jié)相關基因的表達，在糖脂代謝、脂肪形成以及在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，并與多種疾病如糖尿病、肥胖、高血壓、癌癥等的發(fā)生、發(fā)展密切相關。

2 腺病毒載體的結構與特點

腺病毒最早發(fā)現于1953年，由于它們傾向于感染上皮細胞而被命名為腺病毒（Adenovirus，Ady）。腺病毒是直徑為70～90 nm的無囊膜病毒，呈二十面體對稱結構。腺病毒基因組為線狀雙鏈DNA，長度約為36 kb，包裝于二十面體的蛋白質外殼內?；蚪M的末端具有40～200 bp的倒置重復序列（ITR），左端載有包裝信號Es，是腺病毒基因組復制和病毒包裝必不可少的順式作用元件，5’端有共價結合的末端蛋白（TP），與腺病毒的感染有關，對腺病毒DNA的復制起始起著重要的作用，含有TP的DNA其感染性可提高100倍［5］。腺病毒的基因組可分為兩個區(qū)，即編碼區(qū)和非編碼區(qū)。非編碼區(qū)含有順式作用元件。編碼區(qū)又可分為早期轉錄區(qū)和晚期轉錄區(qū)兩種，前者有 El、E2、E3 和 E4 等 4 個區(qū)［6］，編碼病毒的功能蛋白，后者有L1、L2、L3、L4和L5等 5個區(qū)，編碼病毒的結構蛋白。早期轉錄區(qū)各區(qū)所編碼的蛋白均有所差異，El區(qū)是腺病毒感染后轉錄和表達的第一個基因，具有轉錄激活其他病毒基因表達的作用；E2區(qū)則編碼與DNA復制有關的蛋白質；E3區(qū)編碼與病毒逃避宿主免疫監(jiān)視機制有關的蛋白質，可減少感染細胞被機體免疫識別的概率；E4區(qū)基因產物與病毒DNA的復制、晚期基因表達等功能有關。在4個編碼早期蛋白的轉錄區(qū)中，El、E3和E4區(qū)可供插入外源基因。

腺病毒作為基因表達載體的研究起源于20世紀60年代初，當時病毒學家觀察到腺病毒基因組可與猿猴病毒40（SV40）基因組雜交，實質上是腺病毒基因組可承載異源性基因。自此，腺病毒成為病毒學和分子生物學的重要研究對象，其作為基因載體，在重組疫苗和基因治療等方面開發(fā)和應用較早。與其他動物病毒載體比較，腺病毒載體具有以下優(yōu)點：1）宿主范圍廣，對人致病性低，腺病毒廣泛存在于人、哺乳動物和禽類的呼吸道、眼、消化道內，多數毒株為隱性感染，基本不致病或只引起輕微的癥狀［7］。2）腺病毒基因組的結構和功能研究得比較深入，Ad2、Ad5 型的全序列已了解得很清楚［8］。并且腺病毒載體并不整合進宿主細胞基因組，而是以附加體形式游離在宿主細胞基因組外。3）能同時表達多個外源基因，它是第一個可以在同一細胞株或組織中用來設計表達多個基因的表達系統(tǒng)。4）穩(wěn)定。腺病毒顆粒十分牢固，不易突變。5）可容納較大外源基因插入。6）免疫途徑簡便。腺病毒可以在消化道和呼吸道增殖，給苗途徑簡便（口服或氣霧吸入）［9-10］。正是由于具有以上眾多優(yōu)點，如今腺病毒作為載體的研究受到更為普遍的重視。

3 重組腺病毒載體在PPARγ研究中的應用

PPARγ的生物學作用非常廣泛。PPARγ是PPAR家族中最具脂肪細胞專一性的成員，它是脂肪細胞基因表達和胰島素細胞間信號轉導的主要調節(jié)者，參與脂肪細胞分化和糖脂代謝的調節(jié)［11］。其在脂肪細胞的分化過程中不僅能促進前脂肪細胞的分化，而且也能促進非脂肪細胞轉分化成脂肪細胞，與肥胖的發(fā)生、發(fā)展密切相關［12］。 因此，PPAR-γ在脂質代謝中作用機制一直是肥胖和糖尿病研究領域十分關注的問題［13］。明確其靶基因譜有助于理解PPAR-γ對脂質代謝影響的分子機理；對肥胖和糖尿病等復雜疾病的診斷、預防和治療具有積極意義。有研究［13］發(fā)現使用相對非特異性的配體激活PPARγ，能引起脂肪的生成；當使用特異性的配體TZD時，能更強的生成脂肪。說明PPARγ在脂肪細胞分化中發(fā)揮著關鍵性的作用。

此外，PPARγ在輔助激活因子及抑制因子的共同作用下參與癌細胞的分化、形成。許多腫瘤細胞中都發(fā)現PPARγ表達很高，例如胃癌、乳腺癌、結腸癌等，配體激活PPARγ后能抑制上述癌細胞的增殖，促進分化，并誘導其凋亡和抑制癌細胞血管的生成。激活后的PPARγ可通過上調PTEN和p21基因的表達，從而抑制癌細胞的增殖，使細胞周期停留在G1期［14-15］。當PPARγ表達量增加可使甲狀腺腫瘤的生長受到抑制，但在非腫瘤細胞中不能誘導PPARγ的表達［16］。PPARγ過量表達能明顯增加細胞凋亡，這些都說明了PPARγ在癌癥的生成中起重要作用。

PPARγ還有許多重要的生物學作用，若能全面的了解PPARγ的功能，將對許多疾病的治療具有重大意義。腺病毒載體可以使哺乳動物外源基因高水平表達,雖然短暫,但也可表達出占細胞總蛋白30%的重組蛋白。表達后的蛋白質要經過一系列復雜的翻譯、修飾后才能確保正確的折疊及功能。這樣,重組病毒表達的蛋白及哺乳動物的蛋白就與天然蛋白相同,從而避免了這些蛋白在原核生物、真核生物、昆蟲細胞中表達的弊端。成功構建PPARγ的重組腺病毒載體，為進一步研究PPARγ在胰島細胞、脂肪組織、骨骼肌細胞和內皮細胞中的生物學功能奠定良好基礎。

［1］ Holness M J，Samsuddin S，Sugden M C.The role of PPARsinmodulating cardiacmetabolism in diabetes［J］.Pharmacol Res，2009,60（3）:185-194.

［2］ Genini D,Carbone G M,Catapano C V.Multiple interactions between peroxisome proliferators-activated receptors andthe ubiquitin-proteasome system and implications for cancerpathogenesis［J］.PPAR Res,2008:195065.

［3］ Veliceasa D,Schulze Hoepfne F T,Volpert1 OV.PPARγ and agonists against cancer:rational design of complementation treatments［J］.PPAR Res,2008:945275.

［4］ Sheng Z D,Ivashchenko C Y,Usher M G,et al.PPAR-γ in the cardiovascular system［J］.PPAR Res,2008:745804.

［5］ He TC，Zhou S，Da Costa L T，et al.A simplified systemforgenerating recombinantadenoviruses［J］.Proc NatlAcadSciUSA，1998，95（5）：2509-2514.

［6］ Mizuguehi H，Kay M A.Efficient construetion of arecombinantadenovirus vector by an improved in vitroligation method［J］.Hum Gene Ther，1998，9（17）：2577-2583.

［7］ Wolf G.Role of fatty acids in the development of insulinresistance and type 2 diabetes mellitus［J］.Nutr Rev,2008,66（10）:597-600.

［8］ Turner N,Hariharan K,TidAng J,et al.Enhancement ofmusclemitochondrial oxidative capacity and alterations in insulinaction are lipid species dependent:potent tissue-specific effects ofmedium-chain fatty acids ［J］.Diabetes,2009,58（11）:2547-2554.

［9］ Berkner K L.Development of adenovirus vectors for theexpression of heterologous genes［J］.Biotechniques,1988,6:616-629.

［10］ Hatanaka K,Ohnami S,Yoshida K,et al.A simple and efficient method for constructing an adenoviral cDNA expression library［J］.Mol Ther,2003,8：158-166.

［11］ 柳曉峰,李輝.PPAR基因與脂肪代謝調控［J］.遺傳,2006,28（2）:243-248.

［12］ Laffitte B A,Repa J J,Joseph S B,et al.LXRs control lipid-inducibleexpression of the apolipoprotein Egene in macrophages andadipocytes［J］.Proc Natl Acad Sci USA,2001,98（2）:507-512.

［13］ Michael L,Mitchell A L,The Many Faces of PPAR-γ［J］.Cell,2005,123:993-997.

［14］ Wu Z,Xie Y,Bucher N L et al.PPAR（gamma）induces the insulin dependent glucos transporter,GluT4,in the absence of C/EBP （alpha） during the conversion of 3T3 fobroblasts into adipocytes［J］.JClin Invest,1998,101（1）:22-32.

［15］ Kelly L J，Vicario P P，Thompson G M,et al.Peroxisome proliferator activated receptors gamma and alpha mediate in vivo regulation of uncoupling protein（ucp1,ucp2,ucp3） gene expression［J］.Endocrinology,1998,139（12）:4920-4927.

［16］ Hotamisligil G S,Johnson R S,Distel R J，et al.Uncoupling of obesity from insulin resistance through a targeted mutation in the fatty acid binding protein aP2［J］.Science,1996,274（5291）:1377-1379.