傷寒實驗室診斷的研究進(jìn)展

周澤文，趙春茹，周敏

（右江民族醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，廣西 百色 533000 E－mail：13637891292＠126.com）

傷寒是一類由傷寒沙門氏菌感染引起的，以患者持續(xù)發(fā)熱、神情淡漠、脾腫大、皮膚玫瑰疹、相對緩脈和全血白細(xì)胞減少等為主要特征的急性消化道傳染病，其病理變化表現(xiàn)為全身單核－巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的增生性反應(yīng)，以位于回腸下段的淋巴組織增生及壞死為主要表現(xiàn)［1］。目前，腸道感染已成為世界排名第三的疾病病因，傷寒作為其中重要的疾病構(gòu)成，傷寒沙門菌所引起的腸熱癥對人類的健康構(gòu)成重大威脅［2－3］。然而，目前由于檢測方法靈敏度的限制，臨床上難以將傷寒與其他病原體特別是病毒引發(fā)的腸道感染區(qū)分開來，對疾病的診斷和治療以及流行病學(xué)上的控制帶來重大影響。現(xiàn)對傷寒的實驗室診斷方法進(jìn)行整理，綜述如下：

1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

從體液標(biāo)本中培養(yǎng)出傷寒沙門氏菌是目前傷寒診斷的最基本方法，也是診斷傷寒病例的金標(biāo)準(zhǔn)。按使用的標(biāo)本不同，傷寒細(xì)菌的分離培養(yǎng)主要分為：血培養(yǎng)，骨髓培養(yǎng)，糞便培養(yǎng)，尿培養(yǎng)及其他。

1.1 血培養(yǎng) 血培養(yǎng)是目前應(yīng)用最廣泛的傷寒病原學(xué)診斷方法，具有簡便、易行、特異性高的優(yōu)點。然而，這一方法的陽性率容易受到抗生素使用的影響，對未使用抗生素的患者，一般陽性率在病程的前7d最高，可達(dá)80%～90%，到第14～21d可降至50%，隨后迅速降低，而對于使用過抗生素的患者，檢出率相應(yīng)降低［4］。另外，隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，近年來一些新的方法被用于提高傷寒血培養(yǎng)的陽性率，如溶血離心培養(yǎng)法，在血液中加入皂素、OP乳劑等溶解劑后加速振搖使血液溶解，經(jīng)離心后對沉淀進(jìn)行分離培養(yǎng)，這種培養(yǎng)法的陽性率要顯著高于常規(guī)血培養(yǎng)法，且耗時較短。

1.2 骨髓培養(yǎng) 傷寒沙門菌屬于胞內(nèi)菌，不僅存在于網(wǎng)狀細(xì)胞還存在骨髓中，單位體積血液中的細(xì)菌數(shù)明顯少于骨髓。有數(shù)據(jù)顯示，細(xì)菌在骨髓及外周血中的數(shù)量之比在病程第1～7d為4.8，到第14～21d升至158，由于骨髓中的細(xì)菌數(shù)受抗生素的影響相對較小，在患者病情后期及抗生素治療后，骨髓培養(yǎng)法檢出細(xì)菌的靈敏度仍較高，因此骨髓培養(yǎng)尤其適用于病程長和接受過抗生素治療的病人［4］。

1.3 糞便培養(yǎng) 傷寒沙門菌在糞便培養(yǎng)中的敏感性既與病人的病程，抗生素使用情況及病人的個體因素有關(guān)，也與糞便培養(yǎng)的次數(shù)和數(shù)量密切相關(guān)。處于急性期的病人糞便培養(yǎng)陽性率小于30%，隨病程延長，病原菌的檢出率逐漸增加，到21～28 d的陽性率可高達(dá)75%［5］。另外，多次采樣有助于檢出帶菌者。

1.4 尿培養(yǎng) 研究顯示尿培養(yǎng)的陽性率較上述幾種方法低，其中尿培養(yǎng)在病程的21～28d陽性率最高，但仍低于25%［6］，因此在臨床上均不推薦使用。皮膚玫瑰疹的刮取液再培養(yǎng)的方法在臨床上也偶有使用，但是不屬于常規(guī)檢查。

2 血清學(xué)方法

2.1 肥達(dá)試驗 肥達(dá)試驗用于傷寒的輔助診斷已有一百多年歷史了，通常認(rèn)為當(dāng)肥達(dá)反應(yīng)結(jié)果出現(xiàn)O 或H 抗體滴度大于1∶80或1∶160，或恢復(fù)期抗體凝集效價較急性期增高4倍以上則可判定肥達(dá)試驗陽性，再結(jié)合臨床癥狀即可診斷。然而由于這項實驗本身的靈敏度、特異度均不高，受干擾的因素較多，而且臨床上不易同時獲得患者急性期和恢復(fù)期雙份血清，因此，近年來，一系列基于抗原抗體檢測的試驗得以開發(fā)并用于取代肥達(dá)試驗，如檢測傷寒病原菌抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），協(xié)同凝集試驗（SPA－CoA），免疫熒光試驗（IFA）以及檢測抗體的間接血凝試驗（PHA），殺菌抗體試驗（BCAT）等。

2.2 基于抗原檢測的試驗

2.2.1 協(xié)同凝集試驗（SPA－CoA） SPA 是金葡菌表面的A蛋白，具有結(jié)合傷寒桿菌抗血清中IgG 的FC 段的能力。利用SPA 能與患者血清或體液中相應(yīng)抗原反應(yīng)的特點，通過向患者血清或尿液中加入SPA 試劑，觀察協(xié)同凝集反應(yīng)是否發(fā)生來判斷樣本中病原菌抗原的存在，進(jìn)而做出診斷。這一方法具有敏感性和特異性相對較高的特點。

2.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）及酶免疫斑點試驗 相對于通過多克隆抗體檢測患者血液、糞便、尿液中的病原菌抗原的肥達(dá)試驗，用單克隆抗體檢測傷寒病人體液中抗原的試驗特異性更高，更具有臨床應(yīng)用價值。近年來，市面上已出現(xiàn)多種針對傷寒桿菌成分的單克隆抗體，并陸續(xù)用于臨床診斷，使得傷寒免疫診斷的靈敏度和特異性大幅提高，較常見的有抗O9、Vi、以及Barbar蛋白及鞭毛的單克隆抗體。

酶聯(lián)免疫吸附試驗利用雙抗體夾心法（Vi抗體包板及酶標(biāo)Vi抗體）檢測傷寒病人血清和尿液中Vi抗原，具有早期和快速的特點，敏感性較SPA－CoA 高5倍以上。另外，國外也有研究者利用此法檢測患者血清中脂多糖抗體作為傷寒快速診斷的方法，研究顯示該試驗的敏感性和特異性均較肥達(dá)試驗高，且可以用于單份血清的診斷［7］。

酶免疫斑點試驗需要先將傷寒病人早期血清及尿液用乙醇及三氯醋酸進(jìn)行處理，然后滴于硝酸纖維素濾膜上，封膜，加入傷寒沙門菌特異性Vi抗原的單克隆抗體。利用抗原抗體反應(yīng)，結(jié)合酶標(biāo)SPA 達(dá)到檢測目的。此法具有快速、特異性強(qiáng)的優(yōu)點，適用于傷寒早期的快速診斷。

2.3 基于抗體檢測的試驗

2.3.1 間接被動血凝試驗（PHA） 該項試驗使用傷寒沙門菌特異性Vi抗原，可溶性O(shè) 抗原，脂多糖抗原刺激人（O 型血）或綿羊紅細(xì)胞發(fā)生變態(tài)反應(yīng)，進(jìn)而制備血凝抗原，使用該抗原與患者血清進(jìn)行間接血凝試驗，觀察致敏紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)滴度，判斷是否有相應(yīng)特異性抗體的存在。由于傷寒病人消菌治療成功后，Vi－PHA 可以轉(zhuǎn)陰，因此血清中Vi抗體的檢測可用于傷寒帶菌者的篩選以及用于傷寒消菌治療的效果考評。

2.3.2 殺菌抗體試驗 IgM 抗體出現(xiàn)在傷寒感染早期的患者血清中，具有強(qiáng)大的溶菌和殺菌能力，因而稱為殺菌抗體，檢測病人的血清中IgM 抗體，可用于傷寒感染的早期診斷。有研究指出，在傷寒發(fā)病后的2天即可檢測出有臨床指導(dǎo)價值的殺菌抗體［8］。

3 分子生物學(xué)檢測

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，相應(yīng)的分子生物學(xué)手段已逐漸進(jìn)入傷寒的實驗室診斷領(lǐng)域，目前國內(nèi)外研究較多的有傷寒的基因探針檢測、PCR 檢測、蛋白芯片檢測。

3.1 基因探針檢測 基因探針是一段已知的，經(jīng)生物素、同位素或熒光染料標(biāo)記的寡聚核苷酸?；蛱结槞z測就是利用分子雜交原理，通過探針檢測樣本中是否存在與其互補(bǔ)的基因的一種方法，自從問世以來，這種方法已廣泛應(yīng)用于多種病原微生物的檢測。20世紀(jì)80年代，國外學(xué)者率先構(gòu)建了沙門氏菌的特異性DNA 探針［9］，隨后國內(nèi)也有眾多研究者開始構(gòu)建用于傷寒檢測的基因探針。由于放射性探針標(biāo)記技術(shù)的費用較高，并且對人體健康有害，不能廣泛用于實驗室診斷，目前已被酶促化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的酶標(biāo)技術(shù)代替。多項研究顯示，酶標(biāo)基因探針化學(xué)發(fā)光法檢測傷寒桿菌的方法具有敏感性和特異性高的優(yōu)點，同時由于其操作簡便、快速、安全，具有良好的應(yīng)用前景［10］。

3.2 PCR 檢測

3.2.1 常規(guī)聚合酶聯(lián)反應(yīng) 傷寒沙門菌的鞭毛基因存在高度保守區(qū)域，因此可通過PCR 擴(kuò)增出特異的DNA 片段，用于對傷寒早期作出快速診斷。聚合酶鏈反應(yīng)的方法較肥達(dá)反應(yīng)有較高的靈敏度和特異性，并且試驗的周期縮短，可在傷寒感染的早期即可作出診斷，對接受過抗生素治療的患者和懷疑已感染但血培養(yǎng)陰性的患者具有較大的實用價值。然而PCR 可因污染出現(xiàn)假陽性，并且試驗操作相對繁瑣，對環(huán)境要求較高，因此不能用于傷害診斷的大面積推廣。

3.2.2 巢式PCR 巢式PCR 能夠克服傳統(tǒng)PCR 方法病原菌檢出量低的不足，可直接從臨床血液標(biāo)本中檢出病原菌，整個過程耗時短，是一種快速、敏感和特異的的傷寒早期病原菌檢測方法。十多年前國內(nèi)已有很多研究者根據(jù)傷寒桿菌特異的的鞭毛基因序列設(shè)計引物，利用此法快速檢測血液中的傷寒沙門菌，結(jié)果均證實巢式PCR 較傳統(tǒng)PCR 具有更大的潛力用于快速檢測傷害桿菌［11－12］。

3.2.3 多重?zé)晒釶CR 與傳統(tǒng)PCR 每個反應(yīng)只能擴(kuò)增1個模板、反應(yīng)產(chǎn)物需要進(jìn)一步凝膠電泳分析、易出現(xiàn)交叉污染不同，多重?zé)晒釶CR 具有方便快速、特異性高、操作封閉和反應(yīng)產(chǎn)物不需要PCR 后處理的優(yōu)點，是目前公認(rèn)的同時具有高敏感性和高特異性的檢測方法，已廣泛用于微生物的檢測。馬淑貞等用多重?zé)晒釶CR 方法對傷寒，甲乙丙型副傷寒進(jìn)行評估得出該方法檢測傷寒、副傷寒沙門菌的靈敏度和特異度分別高達(dá)100%、98.2%的結(jié)論［13］，提示多重?zé)晒釶CR 法可用于傷寒病原菌的快速檢測，適用于臨床傷寒的早期快速分型診斷。

3.3 蛋白芯片檢測 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的發(fā)展為大面積，高通量樣本的檢測提供了有效手段。蛋白芯片技術(shù)不光有利于傷寒的診斷，還可用于傷寒感染患者的型別分析，為進(jìn)一步的臨床治療提供指導(dǎo)依據(jù)。彭杰雄等［14］利用蛋白芯片技術(shù)將副傷寒抗原（Ta、Tb、Tc）與傷寒抗原To、Th及Vi傷寒莢膜多糖抗原一同檢測，結(jié)果顯示該方法的靈敏度、特異度可分別高達(dá)97.6%、98.0%。由于Vi莢膜多糖抗原可用于篩選帶菌者，而蛋白芯片技術(shù)具有速度快，效率高的特點，因此利用蛋白芯片技術(shù)檢測傷寒特異性抗原可將帶菌者從大規(guī)模的食品從業(yè)人員中快速篩出。

4 其他

除了上述實驗室病原學(xué)檢查方法外，骨髓涂片檢查戒指樣組織細(xì)胞，B細(xì)胞和T 細(xì)胞等形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)檢查均有用于傷寒診斷的報告。另外，影像學(xué)檢查對于傷寒的輔助診斷也具有較大意義。

4.1 骨髓涂片查找傷寒細(xì)胞 通過對傷寒和非傷寒患者的骨髓涂片進(jìn)行比較，我國研究者發(fā)現(xiàn)了傷寒的特異性戒指樣組織細(xì)胞，命名為傷寒細(xì)胞。通過多項試驗證實，傷寒細(xì)胞具有極高的指示作用，與細(xì)菌培養(yǎng)及肥達(dá)反應(yīng)相比，骨髓涂片查找傷寒細(xì)胞敏感性更高，且出現(xiàn)具診斷價值指標(biāo)的時間更早。提示此法可用于傷寒的早期診斷，同時由于這項方法操作簡便，設(shè)備要求簡單，因此具有極大的臨床實用性。

4.2 影像學(xué)檢查 全身范圍內(nèi)的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)發(fā)生增生，特別是回腸下端發(fā)生增生是傷寒的顯著病理特征。利用高頻B超可以清楚檢測到腸壁的增厚范圍、厚度及是否存在回盲部的腫大淋巴結(jié)等情況。傷寒病程的前兩周80%以上的病人會出現(xiàn)回盲部淋巴結(jié)腫大及回腸末端腸壁增厚的病理表現(xiàn)［15］，因此結(jié)合臨床表現(xiàn)，B超也可用于傷寒的早期診斷。

綜上所述，目前實驗室診斷傷寒的方法眾多，但每種方法均各有其優(yōu)缺點。隨著當(dāng)代分子生物學(xué)理論與技術(shù)的不斷發(fā)展以及新型檢測儀器和試劑的研發(fā)，傷寒的實驗室診斷方法將逐步朝著早期、迅速、高敏、特異等方向快速發(fā)展，這些檢測技術(shù)的日臻成熟將為傷寒臨床診斷提供更加有效的科學(xué)依據(jù)。

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