鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白系統(tǒng)在雄性生殖調(diào)控中的研究進(jìn)展

朱桂玉

(泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東泰安 271021)

鈣蛋白酶(calpain)是一個(gè)依賴于Ca2+的半胱氨酸蛋白酶(通過(guò)半胱氨酸位點(diǎn)水解蛋白)，它水解的蛋白能在一系列生理、生化反應(yīng)中發(fā)揮作用，包括細(xì)胞骨架的形成、細(xì)胞增殖、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞調(diào)亡與壞死、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、蛋白的合成和降解等.鈣蛋白酶與多種疾病有關(guān)，包括糖尿病、白內(nèi)障、細(xì)胞硬化癥、癌癥、杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良、老年癡呆等.

1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白

在人類中，鈣蛋白酶家族一共有14個(gè)成員，在其眾多成員中，鈣蛋白酶1(calpain－1/μ－calpain)和鈣蛋白酶2(calpain－2/m－calpain)研究的最為深入.體外研究表明，各calpain成員對(duì)Ca2+的敏感度不同，5－50μM的Ca2+濃度能刺激calpain－1達(dá)到最大活性，而當(dāng)Ca2+濃度為0.2－1μM能使calpain－2 活性達(dá)到最大.［1］

Calpain的眾多成員按其表達(dá)規(guī)律可以大致分為兩類，第一類是在各種細(xì)胞中組成性表達(dá)的，包括calpain －1，2，5，7，10，13 和15;其余的只在某一種或幾種細(xì)胞中表達(dá)，包括 calpain －3，6，8，9，11 和 12.比如calpain－11只在睪丸中表達(dá)，calpain－6只在胎盤中表達(dá)，calpain－3在骨骼肌，心肌和肝中特異表達(dá)［2］.

Calpain的激活原理以及其作用于靶蛋白的具體機(jī)制非常復(fù)雜，calpain的活性可以被一種特異的鈣蛋白酶抑制蛋白(calpastatin)所調(diào)控，而迄今所確定的calpastatin的唯一作用就是抑制calpain的活性.Calpastatin由唯一一個(gè)基因編碼，但是它卻能運(yùn)用不同位置的啟動(dòng)子以及選擇性剪切產(chǎn)生十幾種異構(gòu)體，最后翻譯成分子量為17－100多kDa不等的各種蛋白.雖然產(chǎn)生大量異構(gòu)體的具體作用還有待于進(jìn)一步研究，但它們都能結(jié)合到calpain上的三個(gè)位點(diǎn)，其中兩個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合必須有Ca2+的參與［1］.

由于calpain－calpastatin系統(tǒng)在一系列生理過(guò)程中發(fā)生重要作用，因此機(jī)體需要對(duì)其進(jìn)行精細(xì)而有效的調(diào)節(jié)，近年來(lái)，隨著對(duì)calpain和calpastatin系統(tǒng)在生殖發(fā)育中的研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)calpain－calpastatin系統(tǒng)對(duì)精子和卵母細(xì)胞的發(fā)育、頂體反應(yīng)、受精以及一些常見(jiàn)生殖疾病，如睪丸扭轉(zhuǎn)、妊娠高血壓綜合癥等有重要作用，本文將對(duì)calpain－calpastatin系統(tǒng)在雄性生殖發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行下總結(jié).

2 雄性生殖系統(tǒng)中鈣蛋白酶—鈣蛋白酶抑制蛋白的調(diào)控

最早關(guān)于calpain－calpastatin系統(tǒng)在雄性生殖發(fā)育中的研究始于1986年，Schollmeyer用免疫熒光技術(shù)將calpain－2定位于豬精子的頂體部位和中心粒附近，考慮到頂體反應(yīng)和Ca2+濃度密切相關(guān)，因此Schollmeyer預(yù)測(cè)calpain－2可能參與了頂體反應(yīng)［3］.Rojas等第一次在人的精子細(xì)胞內(nèi)對(duì)calpain－calpastatin系統(tǒng)進(jìn)行了較全面的定位研究，發(fā)現(xiàn)calpain－1和calpain－2在精子細(xì)胞中都有分布，同時(shí)，他用免疫印記的方法獲得了一條68 kDa大小的calpastatin蛋白條帶［4］，也有研究人員在人精子細(xì)胞中得到了除68kDa以外的另一條為110kDa左右的calpastatin蛋白［5］.

Calpain家族眾多成員中已經(jīng)確定calpain－1，calpian－2和calpain－11在睪丸中存在，通過(guò)western雜交證明精子中的calpain－1和calpain－2蛋白與其他組織中的并無(wú)差異［4，6］，而calpain－11則是在睪丸中生精細(xì)胞特異表達(dá)，其蛋白序列和結(jié)構(gòu)與較保守的calpain－1和calpain－2有一定的區(qū)別，但其主要功能域都是保守的［7］.人的睪丸特異calpastatin蛋白大小大約為68kDa，由一個(gè)40個(gè)氨基酸組成的N端結(jié)構(gòu)域和結(jié)構(gòu)域II，III和IV組成，其中N端結(jié)構(gòu)域?yàn)椴G丸特異的，其余結(jié)構(gòu)域部分和其他體細(xì)胞calpastatin蛋白完全一樣［5］.通過(guò)綠色熒光蛋白示蹤技術(shù)對(duì)其N端結(jié)構(gòu)域進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其能引導(dǎo)calpastatin蛋白定位于膜上.而在小鼠中睪丸特異calpastatin蛋白中也觀察到了類似的N端結(jié)構(gòu)域，并發(fā)現(xiàn)這個(gè)結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)十四烷基化位點(diǎn)對(duì)其膜定位有關(guān)鍵作用，對(duì)這個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變后calpastatin均勻分布于精子內(nèi)［5］.

2.1 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白在精子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)

Sultana研究了calpain在精子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)calpain1在大鼠生長(zhǎng)到20－25天左右時(shí)，即精母細(xì)胞(spermatocytes)發(fā)生減數(shù)分裂的旺盛時(shí)期，睪丸中的calpain－1基因表達(dá)量有顯著的升高，他預(yù)測(cè)calpain－1在精子細(xì)胞發(fā)生過(guò)程中有重要作用，而calpain－2保持相對(duì)穩(wěn)定［8］.在小鼠中，在精子發(fā)育的各個(gè)階段都能檢測(cè)到calpain－1和calpain－2的mRNA以及蛋白的表達(dá)，而calpain－1在晚期的次級(jí)精母細(xì)胞(second spermatocytes)和早期的精細(xì)胞(spermatids)中表達(dá)量顯著升高［9］，這一現(xiàn)象與大鼠中的相同.Calpain－2在小鼠精子發(fā)育中的表達(dá)也相對(duì)穩(wěn)定，與calpain－1不同的是，calpain－2在輸精管的周圍細(xì)胞中也有少量表達(dá)［9］.Calpain－11是睪丸特異表達(dá)的蛋白，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)calpain－11的mRNA和蛋白在處于粗線期的精母細(xì)胞(pachytene spermatocytes)中才開(kāi)始表達(dá)，同樣在成熟精子的頂體部位也能檢測(cè)到其蛋白存在［7］.

Wei等利用熒光原位雜交技術(shù)對(duì)calpastatin在人睪丸中進(jìn)行了定位和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)calpastatin的mRNA在精細(xì)胞中大量分布，由于精細(xì)胞是由次級(jí)精母細(xì)胞經(jīng)過(guò)第二次減數(shù)分裂后產(chǎn)生的，說(shuō)明calpastatin在減數(shù)分裂后的精子發(fā)育中有重要作用［10］.同樣，在小鼠中，calpastatin基因只在單倍體的生殖細(xì)胞中表達(dá)，如精細(xì)胞，而在雙倍體的生殖細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，如精母細(xì)胞［5］.

總結(jié)各研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，calpain－1和calpain－2在各種生精細(xì)胞中都有表達(dá)，而calpastatin在還未發(fā)生減數(shù)分裂的精母細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)，只在進(jìn)入減數(shù)分裂后的精母細(xì)胞中表達(dá)，由于發(fā)生減數(shù)分裂的精母細(xì)胞是發(fā)生調(diào)亡程度較高的細(xì)胞，因此calpastatin的這種時(shí)期特異表達(dá)可能與精母細(xì)胞的調(diào)亡有一定聯(lián)系.精母細(xì)胞自身發(fā)生調(diào)亡，將活力低和有突變的細(xì)胞淘汰掉對(duì)提高精子質(zhì)量有重要作用.Somwaru等成功的用轉(zhuǎn)基因小鼠的方法將calpastatin基因在精母細(xì)胞中進(jìn)行異位表達(dá)，接著利用熱刺激誘導(dǎo)睪丸內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡，結(jié)果顯示粗線期的精母細(xì)胞是發(fā)生調(diào)亡程度最高的細(xì)胞，而轉(zhuǎn)基因小鼠中調(diào)亡細(xì)胞的數(shù)量比正常小鼠顯著減少，說(shuō)明calpastatin有抑制精母細(xì)胞調(diào)亡的作用［11］.Coureuil等利用一個(gè)不育轉(zhuǎn)基因小鼠品系(MTp53)，該小鼠能在次級(jí)精母細(xì)胞和精細(xì)胞中異位過(guò)表達(dá)P53，使這些細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡而產(chǎn)生不育.經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)calpain－1在這兩類細(xì)胞中表達(dá)升高，而當(dāng)加入calpain的抑制劑后，細(xì)胞的調(diào)亡現(xiàn)象在一定程度上被抑制，說(shuō)明calpain在這兩類細(xì)胞的調(diào)亡過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用［12］.以上結(jié)果分別從正反兩方面證明了calpain－calpastatin系統(tǒng)在生精細(xì)胞的末端分化和調(diào)亡過(guò)程中發(fā)揮了重要作用.

2.2 鈣蛋白酶和鈣蛋白酶抑制蛋白在精子中的分布與頂體反應(yīng)

研究人員對(duì)calpain－calpastatin蛋白在精子中的空間分布規(guī)律進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)calpain主要分布在精子頭部的頂體部位［5，6，9］以及頸部［13］，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)在短尾獼猴的精子的頂體外膜和細(xì)胞漿膜之間，分布于大量的calpain－1和calpain－2蛋白［14］.Calpastatin蛋白也主要分布在精子頭部相同的區(qū)域［14］.Ozaki等發(fā)現(xiàn)在體外的精子中加入少量孕酮后，精子內(nèi)的鈣離子濃度顯著升高，同時(shí)還使calpain－1蛋白，由頭頸部轉(zhuǎn)移到頸部和尾部，但是具體機(jī)制不明確［13］.

獲能的精子滲入卵母細(xì)胞前要發(fā)生頂體反應(yīng)(acrosome reaction)，而Ca2+是頂體反應(yīng)中所必須的，calpain－calpastatin蛋白在頂體附近的分布以及其與Ca2+濃度的密切關(guān)系說(shuō)明該系統(tǒng)可能在頂體反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用.Rojas和Moretti－Rojas最早對(duì)calpain－calpastatin系統(tǒng)在頂體反應(yīng)中的作用進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在精子中加入calpain的抑制因子(calpain inhibitor－I)后，精子的滲入率顯著降低，但是該抑制因子對(duì)精子活力以及卵母細(xì)胞沒(méi)有明顯作用，此外，加入calpain－1和calpain－2的抗體同樣對(duì)頂體反應(yīng)有抑制作用［15］.隨后，大量研究表明calpain的各種抑制劑能不同程度的降低精子活力以及抑制頂體反應(yīng)的發(fā)生［6，13，9，16］.Ashizawa等首次對(duì)禽類的精子中的 calpain 蛋白進(jìn)行了研究，由于禽類動(dòng)物的體溫為40℃，其頂體反應(yīng)和受精機(jī)理與哺乳動(dòng)物有一定的區(qū)別.Ashizawa等發(fā)現(xiàn)Ca2+濃度在雞的精子活力和頂體反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，體外實(shí)驗(yàn)表明，Ca2+濃度升高可以提高雞精子的活力和促進(jìn)頂體反應(yīng)，而用PD 150606(特異的calpain抑制劑)對(duì)精子進(jìn)行處理后，對(duì)頂體反應(yīng)沒(méi)有影響，但對(duì)精子的活力有抑制作用，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PD 150606對(duì)去膜后的精子的活力沒(méi)有影響，說(shuō)明發(fā)揮功能的calpain蛋白主要分布在雞精子的膜部位［16］.

3 鈣蛋白酶－鈣蛋白酶抑制蛋白與某些雄性生殖疾病的關(guān)系

雄性哺乳動(dòng)物的睪丸扭轉(zhuǎn)(Testicular torsion)會(huì)導(dǎo)致睪丸內(nèi)細(xì)胞的缺血并發(fā)生壞死或者調(diào)亡，細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生大量的一氧化氮，同時(shí)calpain蛋白的活性也顯著升高，在此過(guò)程中如加入calpain的抑制劑，抑制calpain的蛋白水解活性，可以抑制精原細(xì)胞的調(diào)亡和壞死，從而說(shuō)明抑制calpain可以對(duì)睪丸扭轉(zhuǎn)損傷的恢復(fù)有一定作用，calpain蛋白可以作為治療睪丸扭轉(zhuǎn)一個(gè)藥物靶點(diǎn)［17－18］.Umemoto等進(jìn)一步研究了發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)過(guò)程中未發(fā)生損傷的細(xì)胞中的calpain蛋白的變化，發(fā)現(xiàn)當(dāng)大鼠一側(cè)的睪丸發(fā)生睪丸扭轉(zhuǎn)損傷后，在另一側(cè)的睪丸的精母細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)了大量的calpain－1，而calpain－2沒(méi)有觀察明顯的變化，在未發(fā)生損傷的外周細(xì)胞中同樣發(fā)現(xiàn)了調(diào)亡的現(xiàn)象，而calpain抑制劑也可以抑制這些細(xì)胞的調(diào)亡［19］.

4 展望

總之，目前的研究表明calpain－calpastatin在雄性生殖系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用.隨著對(duì)calpaincalpastatin在生殖系統(tǒng)中的研究的逐漸深入，有望對(duì)這一系統(tǒng)在生殖調(diào)控方面的功能和發(fā)揮作用的具體機(jī)制有更準(zhǔn)確的了解，在臨床上可以利用它們作為藥物的靶位點(diǎn)，為治療相關(guān)疾病提供新途徑，還可以運(yùn)用到動(dòng)物生產(chǎn)領(lǐng)域，提供動(dòng)物的繁殖力，更好的為人類服務(wù).

［1］Goll D E，Thompson VF，Li H，et al.The calpain system［J］.Physiol Rev，2003，83(3):731 －801.

［2］單體中，汪以真.鈣蛋白酶系統(tǒng)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)飼料，2006(7):2.

［3］Schollmeyer J E.Identification of calpain II in porcine sperm［J］.Biol Reprod，1986，34(4):721 －731.

［4］Rojas FJ，Brush M，Moretti－Rojas I.Calpain－calpastatin:a novel，complete calcium －dependent protease system in human spermatozoa［J］.Mol Hum Reprod，1999，5(6):520 － 526.

［5］Li S，Goldberg E.A novel N － terminal domain directs membrane localization of mouse testis－ specific calpastatin［J］.Biol Reprod，2000，63(6):1594 －1600.

［6］Aoyama T，Ozaki Y，Aoki K，et al.Involvement of mu － calpain in human sperm capacitation for fertilization［J］.Am J Reprod Immunol，2001，45(1):12 －20.

［7］Ben － Aharon I，Brown P R，Shalgi R，et al.Calpain 11 is unique to mouse spermatogenic cells［J］.Mol Reprod Dev，2006，73(6):767－773.

［8］Sultana T，Wahab－Wahlgren A，Assmus M，et al.Expression and regulation of the prointerleukin－1alpha processing enzymes calpain I and II in the rat testis［J］.Int J Androl，2003，26(1):37 － 45.

［9］Ben － Aharon I，Brown P R，Etkovitz N，et al.The expression of calpain 1 and calpain 2 in spermatogenic cells and spermatozoa of the mouse［J］.Reproduction，2005，129(4):435 －442.

［10］Wei S G，Wang L F，Miao S Y，et al.Expression of the calpastatin gene segment during spermiogenesis in human testis:an in situ hybridization study［J］.Arch Androl，1995，34(1):9 －12.

［11］Somwaru L，Li S，Doglio L，et al.Heat－ induced apoptosis of mouse meiotic cells is suppressed by ectopic expression of testis－ specific calpastatin［J］.J Androl，2004，25(4):506 －513.

［12］Coureuil M，F(xiàn)ouchet P，Prat M，et al.Caspase － independent death of meiotic and postmeiotic cells overexpressing p53:calpain involvement［J］.Cell Death Differ，2006，13(11):1927 －1937.

［13］Ozaki Y，Blomgren K，Ogasawara M S，et al.Role of calpain in human sperm activated by progesterone for fertilization［J］.Biol Chem，2001，382(5):831 －838.

［14］Yudin A I，Goldberg E，Robertson K R，et al.Calpain and calpastatin are located between the plasma membrane and outer acrosomal membrane of cynomolgus macaque spermatozoa［J］.J Androl，2000，21(5):721 － 729.

［15］Rojas F.J.，Moretti－ Rojas I.Involvement of the calcium － specific protease，calpain，in the fertilizing capacity of human spermatozoa［J］.Int J Androl，2000，23(3):163 －168.

［16］Ashizawa K，Wishart G J，Katayama S，et al.Effects of calpain and Rho － kinase inhibitors on the acrosome reaction and motility of fowl spermatozoa in vitro［J］.Reproduction，2006，131(1):71 －79.

［17］Shiraishi K，Naito K，YoshidaK.Inhibition of calpain but not caspase protects the testis against injury after experimental testicular torsion of rat［J］.Biol Reprod，2000，63(5):1538 －1548.

［18］Shiraishi K，Naito K，Yoshida K.Nitric oxide promotes germ cell necrosis in the delayed phase after experimental testicular torsion of rat［J］.Biol Reprod，2001，65(2):514 －521.

［19］Umemoto Y，Ozaki Y，Sasaki S，et al.Involvement of calpain for apoptosis in dysfunction of the unaffected testis in rats with experimental testicular torsion［J］.Am J Reprod Immunol，2001，45(4):239 －245.