牛源大腸桿菌的分離鑒定

郭 伶

（遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，遼寧 錦州 121001）

犢牛大腸桿菌病又稱犢牛白痢，是由大腸桿菌引起的一種急性傳染病，臨床以排出灰白色的稀糞、全身敗血、衰竭和脫水為主要癥狀。大腸桿菌廣泛地分布于自然界，犢牛出生后即可隨乳汁或其他食物進入胃腸道，成為腸道的正常菌。新生犢牛當其抵抗力降低或發(fā)生消化障礙時，均可引起發(fā)病。新生10日齡內(nèi)的奶牛犢發(fā)生以腹瀉為主要癥狀的疾病，具有較高的發(fā)病率、致死率，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重的經(jīng)濟損失［1］。犢牛大腸桿菌病的發(fā)病率和死亡率因有無繼發(fā)和并發(fā)感染、飼養(yǎng)管理水平、環(huán)境衛(wèi)生條件、采取措施是否及時有效而差異較大［2］。2014年2～4月份，遼西某奶牛養(yǎng)殖場發(fā)生了新生犢牛以嚴重腹瀉、脫水等臨床癥狀，發(fā)病的犢牛多為出生后1個月以內(nèi)的小犢牛，有的來不及用藥即發(fā)生死亡，有的治療也無效。經(jīng)對發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品進行致病性大腸桿菌的分離鑒定，并對分離菌株進行藥物敏感性試驗，為臨床合理選擇藥物，有效防治犢牛大腸桿菌病提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 病料采集

從遼西某發(fā)病奶牛養(yǎng)殖場無菌采集病料，將滅菌棉拭子在滅菌生理鹽水中潤濕，在發(fā)生腹瀉犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品，置于0～4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

小白鼠20只，用于致病性試驗，購自遼寧醫(yī)學院實驗動物中心。

1.3 主要儀器設備

顯微鏡、醫(yī)用凈化工作臺、電熱恒溫培養(yǎng)箱、生物安全柜、手提式高壓蒸汽滅菌器等。

1.4 培養(yǎng)基及試劑

培養(yǎng)基：普通肉湯、普通瓊脂培養(yǎng)基、SS瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)、三糖鐵瓊脂斜面、伊紅美藍瓊脂平板、MH培養(yǎng)基（藥敏試驗用培養(yǎng)基）等均按文獻［3］的方法制備。

生化試劑：各種糖發(fā)酵管、MR試劑、VP試劑、硝酸鹽還原試驗用甲液和已液、檸檬酸鹽試劑、吲哚試驗試劑、硝酸鹽、靛基質(zhì)、尿素等，大腸桿菌標準血清（O1、O2、O26、O78）成都生物制品研究所（批號20130901）。藥敏紙片購于上海醫(yī)華醫(yī)學科技有限公司，批號20131008。

2 方法

2.1 涂片、染色鏡檢

將采取糞便樣品進行涂片，經(jīng)革蘭氏染色后，用顯微鏡檢查。

2.2 細菌的分離培養(yǎng)

將采集到的糞便樣品接種于普通肉湯培養(yǎng)基和普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，涂片進行革蘭氏染色后鏡檢。挑取普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上表面光滑，邊緣整齊，灰白色半透明的單個菌落，接種于麥康凱和伊紅美蘭瓊脂平板培養(yǎng)基上，在37℃的條件下培養(yǎng)24h，觀察結果。

2.3 生化試驗

將純培養(yǎng)菌株，移種于乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、半固體瓊脂、尿素瓊脂、三糖鐵和葡萄糖培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)24h，觀察在各種培養(yǎng)基中的生長情況，并進一步進行MR、VP和吲哚試驗。

2.4 血清型鑒定

平板凝集抗原的制備：用0.5%石碳酸緩沖鹽水2ml，將瓊脂斜面的菌落洗下，集于瓶中，121℃高壓處理2h，以破壞其k抗原。

平板凝集反應：取一張清潔的玻片，分別將一滴O1、O2、O8、O26和 O78的大腸桿菌標準血清滴至玻片上，再取等量制備好的平板凝集抗原，與玻片上的標準血清混勻，同時做生理鹽水對照。

2.5 致病性試驗

取健康的小白鼠20只，隨機分成兩組：第一組10只，為試驗組，皮下接種營養(yǎng)肉湯菌液0.1mL，觀察發(fā)病情況；第二組10只，作為對照組，注射生理鹽水。觀察小白鼠發(fā)病情況，對死后的小白鼠組織進行革蘭氏染色、鏡檢、培養(yǎng)性狀觀察、細菌運動性檢查、生化鑒定等。

2.6 藥物敏感性試驗

將分離的大腸桿菌純培養(yǎng)物涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，在每個營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上放置5個藥敏片，置于37℃溫箱培養(yǎng)中培養(yǎng)24h后取出，測量抑菌環(huán)直徑。所用的藥敏紙片有：頭孢噻呋鈉、青霉素、鏈霉素、慶大霉素、恩諾沙星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、磺胺－5－甲氧嘧啶、新霉素、多粘霉素B、氧氟沙星、卡那霉素、丁胺卡那霉素、林可霉素。

3 結果

3.1 涂片染色鏡檢結果

均可見兩端鈍圓，多數(shù)散在排列，偶爾有2～3個連在一起的革蘭氏陰性短桿菌。

3.2 細菌的分離培養(yǎng)

普通肉湯渾濁、形成菌膜、底管有少量沉淀；在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成呈圓形、光滑、不透明、中等大小、粘稠、微隆起、邊緣整齊的菌落；在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上形成中等大小的粉紅色菌落；在血液瓊脂平板上在呈β溶血；在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈現(xiàn)大腸桿菌特有的紫黑色帶金屬光澤菌落。

3.3 生化試驗

分解葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇和蔗糖產(chǎn)氣、產(chǎn)酸；不分解尿素，尿素酶為陰性；硫化氫反應陰性；MR試驗陽性；VP試驗陰性；三糖鐵上的反應情況為表面黃色產(chǎn)酸，底部黃色產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，不產(chǎn)生硫化氫；吲哚試驗陽性。

3.4 血清型試驗

經(jīng)血清型鑒定，在發(fā)病犢牛直腸內(nèi)采取糞便樣品中分離到的菌株為O78。

3.5 致病性試驗結果

注射了肉湯純培養(yǎng)物的小白鼠均發(fā)病死亡，對照組小白鼠未見任何癥狀。死亡小白鼠死前精神萎靡、腹部發(fā)鉗、厭食、被毛蓬松。解剖死亡小白鼠后發(fā)現(xiàn)，肺部有出血點，肝臟、脾臟有不同程度的水腫，無菌采取肝臟、脾臟病料，涂片，革蘭染色、鏡檢，并進行細菌分離培養(yǎng)，所得結果與糞便中分離菌相同。

3.6 藥物敏感性試驗結果

所分離菌株對頭孢噻呋鈉、卡那霉素、氧氟沙星的高度敏感；對磺胺－5－甲氧嘧啶、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、新霉素、四環(huán)素、多粘霉素B中度敏感；對青霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素耐藥。

通過對發(fā)病犢牛的直腸內(nèi)采取糞便樣品進行細菌涂片、染色、鏡檢、分離培養(yǎng)、生化鑒定、致病性試驗結果等可以確定，該牛場犢牛腹瀉病主要是由致病性大腸桿菌引起的細菌性腹瀉。結合藥敏試驗，臨床可首選頭孢噻呋鈉、卡那霉素、氧氟沙星等藥物進行治療。

4 討論

在病原菌的分離鑒定中，應注意無菌操作，以保證分離到病原菌的純培養(yǎng)物。采集病料時，應采取含病原菌最多的部位，以保證能順利分離到病原。待檢材料應該放到滅菌容器中，整個取材過程要求無菌操作。能否獲得純培養(yǎng)，在很大程度上取決于分離技術。

致病性試驗結果表明，分離到的大腸桿菌毒力較強，使小白鼠全部死亡。本次分離到的致病性大腸桿菌經(jīng)血清型鑒定確定其血清型為O78，與東北地區(qū)流行血清型相一致。

近些年來，為了控制和預防某些細菌感染，在飼料添加劑及治療中常盲目使用一些抗菌藥物，導致產(chǎn)生許多耐藥菌株。大腸桿菌易產(chǎn)生對抗生素的耐受性。由藥敏試驗結果可見，對青霉素、環(huán)丙沙星、鏈霉素、林可霉素、丁胺卡那霉素敏感性較低。這可能與該場長期或大量使用該類藥物，使致病菌已產(chǎn)生耐藥性有關?？咕幬锏膹V泛應用以及在疾病治療和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中超量不當使用抗生素，使細菌對一種甚至多種常用抗菌藥物產(chǎn)生耐藥，加之耐藥基因的傳代、轉(zhuǎn)移、傳播、擴散，耐藥病原菌越來越多，耐藥程度越來越嚴重，形成高度和多重耐藥性，嚴重影響藥物治療效果和經(jīng)濟效益。因此建議臨床治療大腸桿菌病時，應先分離出大腸桿菌進行藥敏試驗后，再合理選擇用藥，可縮短治療時間，減少養(yǎng)殖戶的經(jīng)濟損失，同時也避免出現(xiàn)耐藥菌株。

［1］ 王明輝，劉得元.犢牛大腸埃希菌病的發(fā)病原因及防治［J］.中國牛業(yè)科學，2006，32（6）：112－113.

［2］ 宋冰冰，李強.犢牛大腸桿菌病的癥狀分析及防治［J］.畜牧獸醫(yī)科技信息，2010，（11）：42.

［3］ 陸承平.獸醫(yī)微生物學［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2001.