基于紫貽貝Mytilus galloprovincialis表達(dá)序列的核受體家族分析

李娟 ，李崇德

（1.國(guó)家海洋局北海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 青島 266033；2.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所，山東 青島 266071；3.國(guó)家海洋局北海海洋工程勘察研究院，山東 青島 266033）

貽貝屬物種在世界范圍內(nèi)廣泛分布，并且在濱海生態(tài)系統(tǒng)中有著重要的作用，研究較多的物種包括 Mytilus edulis，M.galloprovincialis，M.trossulus和M.californianus等。根據(jù)英文俗稱M.edulis更接近于紫貽貝（bluemussle），M.galloprovincialis因其在地中海周邊分布而被稱為地中海貽貝（Mediterraneanmussle）。兩者在歐洲呈馬賽克式分布，并在邊界處存在一定程度的種間雜交。前者分布在緯度較高的地區(qū)，如蘇格蘭，英格蘭中、北部，而后者分布在低緯度地區(qū)，如英格蘭南部，法國(guó)沿海等地。M.trossulus則被認(rèn)為可能是分布于歐洲更為古老物種 （V?in?l?et al，1991；Varvio et al，1988）。加利福尼亞貽貝M.californianus個(gè)體較大，主要分布于北美西部沿海地區(qū)，在南美也有分布，主要生活在潮間帶（Suchanek，1981）。根據(jù)2008年出版的《中國(guó)海洋生物名錄》 （劉瑞玉，2008），M.galloprovincialis的中文種名是紫貽貝，也有文獻(xiàn)稱其為地中海貽貝（申望等，2011）。該物種自然分布于我國(guó)遼寧、河北、山東等省沿海地區(qū)。20世紀(jì)70年代人工養(yǎng)殖獲得成功后，浙江多地紫貽貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速?，F(xiàn)在紫貽貝不僅是我國(guó)重要養(yǎng)殖品種，也已成為世界范圍研究海洋生物的種群分化、物種形成和環(huán)境監(jiān)測(cè)的一個(gè)非常有意義的模式種（李巧梅等，2013；沈玉幫等，2011）。當(dāng)前氣候變化加劇、污染事件頻發(fā)，深入研究貽貝對(duì)各種污染物及在不同脅迫壓力條件下的生存狀態(tài)尤為重要，而無論是對(duì)毒性物質(zhì)的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，還是生殖繁育和物種分化機(jī)制等貽貝基礎(chǔ)生物學(xué)研究，都有賴于重要物種數(shù)據(jù)的不斷積累。轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù)代表生物體在特定組織某一時(shí)期的基因狀況，是各類生物基礎(chǔ)問題研究的窗口。近年來，大規(guī)模cDNA測(cè)序工作在許多物種中開展，公共平臺(tái)數(shù)據(jù)劇增，大量的表達(dá)數(shù)據(jù)可以部分反映相應(yīng)物種轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而有助于探討相應(yīng)基因和基因家族的結(jié)構(gòu)和特征。

核受體（nuclear receptor，NR）有時(shí)也被稱為核激素受體，是一個(gè)古老的基因家族，廣泛存在于腔腸動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和脊椎動(dòng)物等各種多細(xì)胞動(dòng)物中，是成員組成極復(fù)雜的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。它們參與生命活動(dòng)的各種功能，如體內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡、生殖、發(fā)育、代謝等（de Lera etal，2007；Germain et al， 2006； Huang et al， 2010； Laudet et al，2001）。核受體是受配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，它們作為眾多激素與靶位點(diǎn)的中間橋梁將信號(hào)分子和應(yīng)答性的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)過程直接聯(lián)系。脊椎動(dòng)物中性腺激素受體以及甲狀腺激素受體都是這一基因家族的成員。核受體基因家族的大部分成員具有共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，一個(gè)典型的核受體分子從N端至C端分可以為A/B功能區(qū)、C區(qū)、D區(qū)和E區(qū)。A/B功能區(qū)的可變性最大，其中包含至少一個(gè)非配體依賴性的轉(zhuǎn)錄激活位點(diǎn)即激活功能元件1（active transactivation region（AF-1））和幾個(gè)自助轉(zhuǎn)錄激活區(qū)（transactivation domains（AD））。位于特定位置的酪氨酸、絲氨酸或蘇氨酸殘基能受不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)激酶作用而磷酸化，從而影響受體與配體的親和力和轉(zhuǎn)錄活性。核受體最保守的是C區(qū)中的DNA結(jié)合區(qū)（DNA-binding domain，DBD），及E區(qū)中的配體結(jié)合區(qū)（ligand binding domain，LBD），C區(qū)與E區(qū)之間是保守性較差的作為鉸鏈連接它們的D區(qū)。E區(qū)為多功能區(qū)，是核受體最大的部分，包括數(shù)個(gè)亞區(qū)和基序，除配體結(jié)合口袋（ligand binding pocket，LBP），E區(qū)還含有核受體二聚體化區(qū)和配體依賴性轉(zhuǎn)錄激活功能元件2（AF-2）（Robinson-Rechavietal，2003）?？傮w來說，DBD和LBD是核受體中兩個(gè)最保守的結(jié)構(gòu)域，也往往被用作核受體基因鑒定和分類的典型結(jié)構(gòu)序列。為了避免不同物種核受體家族成員名稱的混亂，1999年由國(guó)際藥理學(xué)委員會(huì)和受體命名與藥物分類聯(lián)合會(huì)專門成立了核受體命名委員會(huì)并在Cell發(fā)文提出核受體系統(tǒng)命名法則（Nuclear Receptors Nomenclature Committee,1999）。此后發(fā)現(xiàn)的新的核受體家族成員也都按此規(guī)則再進(jìn)行系統(tǒng)性的命名。盡管結(jié)構(gòu)相似，核激素受體卻有著與類固醇激素，成型素（維甲酸）、食物組分（脂肪酸）等不同化合物結(jié)合并調(diào)控下游通路的能力，在生物體內(nèi)多種多樣的生理功能、代謝途徑中行使著重要的作用（Escriva etal，2000；Robinson-Rechaviet al，2001）。

本研究通過對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中紫貽貝M.galloprovincialis轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的拼接和比對(duì)，以模式物種核受體特征序列為參考獲取紫貽貝核受體的編碼序列，進(jìn)一步通過系統(tǒng)進(jìn)化分析明確編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和在基因家族中的進(jìn)化位置，從而全面分析該物種這一重要基因家族的組成和結(jié)構(gòu)。本研究不僅為研究紫貽貝核受體功能研究提供寶貴信息，也有助于紫貽貝遺傳分化、生長(zhǎng)繁育等生物問題的深入探討。

1 材料與方法

1.1 紫貽貝轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)的預(yù)處理

通過NCBI（NationalCenter forBiotechnology Information）EST數(shù)據(jù)庫(kù)搜索，目前紫貽貝（M.galloprovincialis）共有19 617條EST序列。在EBI（The European Bioinformatics Institute）的 ENA（European Nucleotide Archive）數(shù)據(jù)庫(kù) （M.galloprovincialis）有60 282條序列。將上述序列下載，并以各核受體基因名稱為關(guān)鍵詞搜索公共數(shù)據(jù)庫(kù)中該物種的核酸和蛋白序列。通過Cross_match去除EST數(shù)據(jù)的載體序列，使用軟件Cap 3對(duì)所有序列進(jìn)行拼接構(gòu)建本地紫貽貝核酸數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2 紫貽貝核受體預(yù)測(cè)

下載人的48個(gè)核受體基因編碼蛋白序列（人的核受體在不同亞家族都有分布并具代表性），通過PFAM結(jié)構(gòu)域分析，使用bioperl提取最為保守的DBD結(jié)構(gòu)域和LBD結(jié)構(gòu)域序列，對(duì)已進(jìn)行拼接的紫貽貝核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地tBLASTn。無論之前是否有基因注釋，對(duì)所有E-value小于0.001的序列進(jìn)行BLASTx同源基因比對(duì)并采用InterPro程序（http：//www.ebi.ac.uk/interpro）進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將紫貽貝核受體與人Homo sapiens、果蠅Drosophilamelanogaster核受體序列的DBD和LBD結(jié)構(gòu)域序列（根據(jù)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)）分別提取形成構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的序列文件。相關(guān)的GenBank序列碼為：CAA31709，AAF51627，CAA34626，AAN11687， AAF51692， AAA28461， AAF52702，AAC46928， AAF45707， Q24142， AAB71371，AAF58145， AAF52303， AAF54133， AAL37554，AAF53914， AAN11667， AAN11107， AAX73355，AAH11564， AAH30207， AAH08851， AAI06931，AAH08727，AAH60794，AAA63254，AAB32649，AAA36469，AAH06811，AAH56148，AAH45613，AAH08831，AAH93774，AAA64751，AAV38218，NP_009052， AAI30574， AAB95155， AAD05436，AAY56401，NP_849180，NP_004124，AAI10999，AAC18599，AAA80681，AAA36761，NP_003289，AAL05871，AAD28301，AAH04154，AAH42897，AAH02669， AAI28575， AAV31779， AAH63795，AAC99409，EAW93335，AAH15610，AAA59571，AAA60081，EAX05380，CAG32985，AAH09288，CAI95138， AAH32501， AAI18572， AAB96828。通過CLUSTALX進(jìn)行蛋白序列的比對(duì)，輔以手工校正。以貝葉斯推斷法（Bayesian Inference）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹采用MrBayes 3.2.1軟件構(gòu)建（Ronquistetal，2003；Ronquistet al，2012）。起始樹設(shè)為隨機(jī)樹（random），馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（Markovchain Monte Carlo process，MCMC）設(shè)置為4條鏈（3條熱鏈，l條冷鏈）同時(shí)運(yùn)行5×106代，每100代對(duì)系統(tǒng)樹進(jìn)行抽樣，最終得到50 001棵系統(tǒng)發(fā)育樹，burnin frequency為10%以確保MCMC的收斂。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫貽貝中核受體序列

在預(yù)處理的紫貽貝轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中，共獲得29條能夠編碼核受體特征序列（DBD或LBD）的轉(zhuǎn)錄本，最短的編碼49個(gè)氨基酸，最長(zhǎng)的編碼678個(gè)氨基酸，命名為類核受體成員MgNRl1-29。根據(jù)InterPro程序分析，其中10條序列編碼1個(gè)DBD和1個(gè)LBD結(jié)構(gòu)域，12條序列只有1個(gè)DBD特征序列，6條序列只有LBD特征序列，值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)1條編碼2個(gè)DBD的轉(zhuǎn)錄本（MgNRl6），在其C端是1個(gè)不完整的LBD序列，形成DBD1-DBD2-LBD結(jié)構(gòu)。Wu等（2007）在曼氏血吸蟲Schistosomamansoni中首次發(fā)現(xiàn)了這類新的非典型的核受體成員，相似的核受體在渦蟲Schmidtea mediterranea和 Dugesia japonica、帽貝Lottia gigantea中也存在，這提示核受體與靶基因DNA序列的相互作用可能存在新的機(jī)制。

圖1多序列比對(duì)結(jié)果顯示，不同DBD結(jié)構(gòu)域之間的序列相似性較高（包括MgNRl6的2個(gè)DBD結(jié)構(gòu)域），大部分含有8個(gè)保守的半胱氨酸氨酸殘基，并形成了兩個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，即C-X2-CX13-C-X2-C（鋅指 1）和 C-Xx-C-X9-C-X2-C（鋅指2），每個(gè)鋅指由4個(gè)半胱氨酸和中心部位的一個(gè)鋅離子鰲合而成，這與其它的典型核受體的DBD結(jié)構(gòu)相同，是與特定DNA位點(diǎn)結(jié)合的部分。鋅指1相關(guān)的P-box也十分保守，參與核受體與DNA結(jié)合的過程。鋅指2相關(guān)的D-box則相對(duì)多變，這是在核受體自身及與其它成員二聚化中起作用的結(jié)構(gòu)，兩個(gè)保守半胱氨酸之間的氨基酸5-7個(gè)不等。在S.mansoni中D-box此處（Xx）有3-9個(gè)氨基酸（Wu etal，2011）。另一重要結(jié)構(gòu)域LBD不及DBD保守，但它們的高級(jí)結(jié)構(gòu)十分相似，都是由 12個(gè) α 螺旋構(gòu)成的 （Moras et al，1998）。LBD是響應(yīng)內(nèi)外激素或其他配體信號(hào)的功能域。已有的研究普遍認(rèn)為，配體結(jié)合特性是在核受體的進(jìn)化過程中獲得的（Bertrand et al，2004）。有的LBD不具有功能性的LBP，無法結(jié)合配體，可能是真正的孤兒受體（Baker etal，2003；Codina et al，2004；Flaigetal，2005）。

圖1 紫貽貝核受體DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多序列比對(duì)

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

本研究通過構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)紫貽貝核受體進(jìn)行分析。貝葉斯推斷法和最大似然法（Maximum Likelihood）緊密相關(guān)，不過它衡量分支的支持率所用的MCMC法要比似然法的自展法速度快，已經(jīng)在大數(shù)據(jù)量的分子進(jìn)化分析廣泛應(yīng)用（Huelsenbeck et al，2001）。因核受體家族是一個(gè)古老的成員眾多的基因家族，借鑒蚤狀溞Daphnia pulex基因家族分析方法，采用了中點(diǎn)定根法（Thomson etal，2009）。如圖2所示，根據(jù)DBD序列構(gòu)建的貝葉斯樹中，NR0、NR3、NR4亞家族及NR2的主要組別分別匯到一起，NR5和NR6亞家族匯成一支，而NR1亞家族的成員分散分布。根據(jù)LBD序列構(gòu)建的貝葉斯樹中，7個(gè)亞家族成員分別聚合，形成更為清晰的分支，最后聚到一起。27個(gè)紫貽貝核受體的進(jìn)化關(guān)系較為明確，其中屬于NR1亞家族的序列最多，為19個(gè)，占65.5%，其中包括HR96、E75、ROR以及2DBD-NR的同源基因；5個(gè)屬于NR2亞家族，包括HNF4、RXR、TLL、SVP的同源基因；2個(gè)屬于NR3亞家族，分別與ESR、ERR同源；還有1個(gè)屬于NR5亞家族，與人NR5A2最為相近。我們?cè)诜治鲞^程中發(fā)現(xiàn)一些核受體的部分序列極其相似，但臨近序列差異較大，推測(cè)可能是同一基因由于可變剪切產(chǎn)生的不同轉(zhuǎn)錄本（例如MgNRl26和MgNRl27）。已經(jīng)進(jìn)行全基因組測(cè)序的長(zhǎng)牡蠣Crassostrea gigas的核受體成員就普遍存在可變剪切現(xiàn)象。但根據(jù)現(xiàn)有的數(shù)據(jù)不能完全排除由不同拷貝的同源基因分別轉(zhuǎn)錄形成或不同個(gè)體發(fā)生變異產(chǎn)生的可能。

在軟體動(dòng)物核受體的相關(guān)研究中，最受關(guān)注的是ESR（estrogen receptor，雌激素受體）和RXR（retinoid X receptor，維甲酸X受體）。很多軟體動(dòng)物都具有雌激素受體同源基因，紫貽貝核受體MgNRl23在進(jìn)化關(guān)系上也與人雌激素受體十分接近，但目前一般認(rèn)為軟體動(dòng)物的ESR同源基因并不像高等動(dòng)物那樣能夠與雌激素特異結(jié)合。海兔中ESR同源基因的研究表明其能與多種類固醇及外源物質(zhì)發(fā)生作用，可能作為感受器存在（Thornton etal，2003）。一些軟體動(dòng)物中這一核受體是組成型表達(dá)的并且似乎與雌激素并不結(jié)合（Baker etal，2007；Keay etal，2006；Thornton etal，2003）。章魚ESR同源基因的分子結(jié)構(gòu)模型研究顯示存在空間沖突使它不可能與雌激素結(jié)合（Baker et al，2007）。腹足類軟體動(dòng)物作為內(nèi)分泌干擾模型被廣泛研究，一些種類對(duì)環(huán)境污染物有機(jī)錫非常敏感，雌性個(gè)體會(huì)被誘導(dǎo)形成雄性性器官和輸精管，出現(xiàn)性 逆 轉(zhuǎn) （imposex）現(xiàn) 象 （Gibbs et al，1988；Horiguchietal，1997）。RXR在三丁基錫誘導(dǎo)的蚵巖螺Thais clavigera中表達(dá)上調(diào)，特別是在卵巢和性逆轉(zhuǎn)形成雄性性器官的組織中（Horiguchietal，2010）。對(duì)荔枝螺Nucella lapillus、鳳螺Babylonia japonica、鮑Haliotismadaka以及H.gigantea的研究均支持RXR在有機(jī)錫誘導(dǎo)腹足類性逆轉(zhuǎn)機(jī)制中發(fā)揮著重要作用（Codina et al，2004；Horiguchi，2006）。紫貽貝的類雌激素受體、類維甲酸X受體及其它核受體的生理作用，對(duì)毒性物質(zhì)的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制還有待更深入的功能性研究。

圖2 核受體的貝葉斯系統(tǒng)進(jìn)化樹

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