153例內(nèi)蒙古漢族人群載脂蛋白（a）五核苷酸重復(fù)序列基因多態(tài)性與乳腺癌的關(guān)系＊

周 靜，劉翠萍，韓明玥

（1.赤峰學(xué)院醫(yī)學(xué)院分子生物教研室，內(nèi)蒙古赤峰 024000；2.赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科，內(nèi)蒙古赤峰 024000）

脂蛋白（a）［Lp（a）］由蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)兩部分組成，其中，脂類物質(zhì)與低密度脂蛋白（LDL）相似，主要為膽固醇，而蛋白質(zhì)部分由apoB－100和載脂蛋白［apo（a）］通過(guò)二硫鍵共價(jià)結(jié)合而成。apoB－100是疏水性蛋白質(zhì)，部分被包埋于Lp（a）顆粒內(nèi)部，分子量無(wú)明顯個(gè)體差異，而編碼apo（a）的基因具有多態(tài)性，且其表型具有地區(qū)種族差異性、受遺傳基因控制、每一個(gè)個(gè)體的基因型是終身固定的，不會(huì)因身體狀況而發(fā)生改變，因此，apo（a）的基因型決定了Lp（a）的特性。研究發(fā)現(xiàn)，位于apo（a）基因啟動(dòng)子區(qū)域上游信號(hào)序列五核苷酸（TTTTA）n重復(fù)序列（pentanucleotide repeat，PNR）的重復(fù)次數(shù)與血漿 Lp（a）濃度大致呈負(fù)相關(guān)，即重復(fù)數(shù)目多伴隨低血漿Lp（a）濃度。

表1 健康對(duì)照與乳腺癌患者血脂水平比較（）

表1 健康對(duì)照與乳腺癌患者血脂水平比較（）

a：P＜0.05，b：P＜0.01，與健康對(duì)照組比較。

組別 CH（mmol／L） TG（mmol／L） LDL－C（mmol／L） HDL－C（mmol／L） Lp（a）（mg／L）健康對(duì)照組 4.32±0.68 1.02±0.32 2.10±0.59 1.02±0.20 155.77±70.33乳腺癌組 4.89±0.47 1.45±0.91a 2.45±0.41 1.20±0.32a 245.12±142.57b

女性乳腺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，且近年來(lái)國(guó)內(nèi)女性乳腺癌發(fā)病率越來(lái)越高。大量的研究已發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者的血漿Lp（a）水平明顯高于健康人群，特別是與性激素水平密切相關(guān)的惡性腫瘤患者血漿Lp（a）濃度增高更加明顯［1］。另外，Yang等［2］也發(fā)現(xiàn)原發(fā)性肺癌男性患者血漿Lp（a）濃度的變化與癌癥的發(fā)展具有相關(guān)性。那么在內(nèi)蒙古地區(qū)漢族乳腺癌患者血漿Lp（a）水平是如何變化的呢？乳腺癌患者apo（a）PNR的等位基因及基因型分布的特點(diǎn)又是什么呢？

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象來(lái)源于赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院乳腺外科明確診斷為乳腺癌的住院漢族患者（乳腺癌組），共計(jì)153例，平均年齡（52.37±6.28）歲。健康對(duì)照選自赤峰學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢及在校學(xué)生未患動(dòng)脈粥樣硬化、肝臟疾病、糖尿病及癌癥的健康漢族人群（健康對(duì)照組），共計(jì)143例，平均年齡（30.08±8.34）歲。

1.2 方法

1.2.1 血脂水平的測(cè)定 采集清晨空腹受檢者EDTA－Na2抗凝靜脈血4mL，及時(shí)分離血漿，密閉－20℃以下冰箱保存，5d內(nèi)檢測(cè)。血漿Lp（a）測(cè)定使用免疫透射比濁法，血漿總膽固醇（TG）、三酰甘油（TC）測(cè)定選用酶學(xué)終點(diǎn)分析法，血漿高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）采用磷鎢酸－鎂沉淀法進(jìn)行測(cè)定，血漿低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）采用聚乙烯硫酸鹽沉淀法進(jìn)行測(cè)定。為確保測(cè)定結(jié)果可靠，每批標(biāo)本測(cè)定均做標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做質(zhì)控。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 血細(xì)胞經(jīng)過(guò)0.2%的NaCl低滲溶液破碎紅細(xì)胞，分離出白細(xì)胞后，用北京百泰克生物技術(shù)有限公司的細(xì)胞／組織基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，并測(cè)定其濃度。

引物設(shè)計(jì)參照胡波等設(shè)計(jì)［3］，由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，序列為上游：5′－GAA TTC ATT TGC GGA AAG ATT G－3′；下 游：5′－CTT AAC CGG GGT GAG AGT CTC－3′。特異性擴(kuò)增apo（a）5′端調(diào)控信號(hào)區(qū)（TTTTA）n序列，序列長(zhǎng)度約為100bp。

PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性90s；以下程序循環(huán)35次，94℃變性40s，60℃退火30s，72℃延伸40s；最后72℃再延伸5min，4℃保存。取產(chǎn)物3μL經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外燈下觀察電泳結(jié)果。

1.2.3 apo（a）PNR基因多態(tài)性的檢測(cè) 按照丙烯酰胺：N、N′－甲叉雙丙烯酰胺50.0∶2.5的比例配制10%的聚丙烯酰胺凝膠。150V4℃預(yù)電泳30min，加樣1.5μL后再150V于4℃電泳10h。電泳結(jié)束后，凝膠首先在10%醋酸溶液中固定10min，蒸餾水沖洗1～2次后，于0.2%硝酸銀溶液中染色10 min，水洗3～5次，再于含有0.4%甲醛的1.5%NaOH溶液中顯色，最后用0.75%的Na2CO3溶液終止。染色后的凝膠用quantity one軟件分析各條帶相對(duì)分子質(zhì)量。

1.2.4 DNA序列測(cè)定 挑選在聚丙烯酰胺凝膠電泳中apo（a）（TTTTA）串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)為5、8、9的純合體樣品各2個(gè)用pGEM－T載體克隆，送至北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，apo（a）PNR等位基因和基因型頻率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，組間等位基因與基因型頻率比較采用χ2檢驗(yàn)，組間血脂水平及組內(nèi)不同基因型血脂水平比較均采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血脂水平比較 乳腺癌組與健康對(duì)照組各血脂水平比較，乳腺癌患者血漿TG、Lp（a）及 HDL－C水平均顯著性高于健康對(duì)照組，見表1。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) apo（a）5′端調(diào)控區(qū)信號(hào)密碼子上游1373bp處的（TTTTA）n五核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)100bp處有單一條帶，見圖1。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果

表2 健康對(duì)照組與乳腺癌組apo（a）PNR等位基因頻率分布比較

2.3 等位基因與基因型頻率分布 兩組人群檢測(cè)出分子量分別為81、91、96、101bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，對(duì)應(yīng)的五核苷酸重復(fù)次數(shù)分別為5、7、8、9共4種等位基因，其中，乳腺癌患者中檢測(cè)出重復(fù)次數(shù)為5、8、9的3種等位基因，兩組apo（a）PNR等位基因頻率見表2。應(yīng)用相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)率（RR）Wolf公式＝ad／bc［a為攜帶（TTTTA）5的乳腺癌患者等位基因數(shù)目，b為不攜帶（TTTTA）5的乳腺癌患者等位基因數(shù)目，c為攜帶（TTTTA）5的健康人群等位基因數(shù)目，d為不攜帶（TTTTA）5的健康對(duì)照人群等位基因數(shù)目］［4］，評(píng)估apo（a）PNR基因多態(tài)性與乳腺癌發(fā)生的關(guān)聯(lián)性時(shí)發(fā)現(xiàn)，（TTTTA）5的等位基因與乳腺癌的發(fā)生存在負(fù)相關(guān)（RR＝0.3030，χ2＝8.96，P＜0.05）。

表3 健康對(duì)照與乳腺癌組apo（a）PNR基因型頻率分布比較

另外，兩組人群檢測(cè)出5／8、5／9、5／5、7／9、8／8、8／9、9／9共7種基因型，見圖2，其中，乳腺癌患者中檢測(cè)出5／8、5／9、5／5、8／8、8／9、9／9共6種基因型，兩組apo（a）PNR基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

乳腺癌患者中apo（a）PNR中8／8與8／9基因型的血漿Lp（a）水平分別為（232.12±99.05）mg／L和（215.27±80.38）mg／L，通過(guò)t檢驗(yàn)比對(duì)發(fā)現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其他幾種基因型病例數(shù)太少，未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

圖2 apo（a）PNR基因多態(tài)性PCR產(chǎn)物圖譜

3 討 論

Lp（a）是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，即血漿Lp（a）濃度高的人群更易患動(dòng)脈粥樣硬化。apo（a）作為L(zhǎng)p（a）重要的組成成分，其氨基酸組成及基因結(jié)構(gòu)與纖溶酶原十分相似。因此，Lp（a）能夠競(jìng)爭(zhēng)性抑制纖溶酶原激活，干擾纖溶酶原與纖維蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及血小板結(jié)合，延緩血塊溶解，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的進(jìn)程，促進(jìn)血栓的形成。本研究測(cè)定乳腺癌患者血漿Lp（a）平均水平為（245.12±142.57）mg／L顯著性高于健康對(duì)照組，且接近于湖北地區(qū)漢族AS患者、冠心病患者的Lp（a）平均水平（239.9＋225.4）mg／L、（247＋225）mg／L［4］，及心肌梗死、腦梗死患者血漿Lp（a）的平均水平263mg／L和297mg／L［5］。因此，高血漿Lp（a）水平的乳腺癌患者更易形成血栓。血栓的形成有助于腫瘤細(xì)胞附著于血管壁，并為其快速增殖提供能量物質(zhì)和生長(zhǎng)因子，且可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞不受到機(jī)體防御機(jī)制的識(shí)別，加快腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［6］。因此，乳腺患者機(jī)體內(nèi)過(guò)高的血漿Lp（a）水平在一定程度上有助于腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，應(yīng)給予有效的降低血漿Lp（a）水平的治療，但傳統(tǒng)的降血脂藥物對(duì)血漿Lp（a）水平的影響并不明顯，Kyutoku等［7］開發(fā)了一種DNA疫苗能夠有效地降低血漿Lp（a）水平。

本次實(shí)驗(yàn)測(cè)得乳腺癌患者Lp（a）的標(biāo)準(zhǔn)差高達(dá)142.57 mg／L，這是因?yàn)檠獫{Lp（a）水平在不同個(gè)體間的差異較大，同時(shí)也說(shuō)明了，雖然高濃度的血漿Lp（a）水平在一定程度上有助于腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，但腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移不一定伴隨著高濃度的血漿Lp（a）水平。

本次研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)蒙古地區(qū)漢族人群共存在4種apo（a）5′端PNR等位基因和7種基因型，分別為5、7、8、9和5／8、5／9、5／5、7／9、8／8、8／9、9／9，明顯少于 Trommsdorff等［8］發(fā)現(xiàn)的黑種人、歐美白種人、胡波等［4］發(fā)現(xiàn)的湖北地區(qū)漢族人群及梁紅艷等［9］發(fā)現(xiàn)的哈爾濱地區(qū)人群的等位基因和基因型的種類，但是序列重復(fù)數(shù)為8的等位基因頻率均最高。這可能與apo（a）具有地區(qū)、種族的差異有關(guān)，也可能是那些基因型分布頻率太低，未能被及時(shí)發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的4種等位基因中，乳腺癌患者（TTTTA）5等位基因頻率明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05），且（TTTTA）5等位基因與乳腺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，但因乳腺癌患者中（TTTTA）5／病例數(shù)太少，因此未對(duì)其血漿Lp（a）水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。但胡波［4］、劉曉寧［5］、梁紅艷等［9］均發(fā)現(xiàn)，apo（a）PNR（TTTTA）5等位基因與高血漿 Lp（a）水平相關(guān)。胡波等［10］還發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死、冠心病等患者（TTTTA）5等位基因頻率顯著性高于健康對(duì)照人群，且與疾病的發(fā)生密切正關(guān)聯(lián)。

綜上所述，研究結(jié)果可能說(shuō)明攜帶（TTTTA）5等位基因的人群易患動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，但因?yàn)槿橄侔┑陌l(fā)生是遺傳因素及環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，（TTTTA）5等位基因的人群相對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的其他apo（a）PNR（TTTTA）n基因型而言不易患乳腺癌，但是攜帶（TTTTA）5等位基因的人群可能易患動(dòng)脈粥樣硬化性疾病，即血漿Lp（a）水平高的人群不易患乳腺癌，但是發(fā)病后，高濃度的血漿Lp（a）水平可能更有助于腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，且患動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的風(fēng)險(xiǎn)率也很高。因此，如果可以開展廣泛的基因篩選的話，有助于人們了解自身易患疾病，從而及早采取干擾、預(yù)防等措施。

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