低鉀型周期性麻痹相關(guān)的Cchl1a3基因R528H敲入小鼠模型的構(gòu)建

雍曾花，徐宏燕，王大鵬，王曉英，姚合斌,

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院，北京 100048；2.解放軍海軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100048；3.解放軍海軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100048)

低鉀型周期性麻痹(hypokalemic periodic paralysis，HypoPP)是一組以反復(fù)短暫發(fā)作性肌無力伴隨血清鉀降低為特征的常染色體顯性遺傳性離子通道疾病。其中，家族性低鉀型周期性麻痹(familial hypokalemic periodic paralysis，F(xiàn)HypoPP)為最常見的形式，主要涉及的離子通道基因有CACNA1S、SCN4A和KCNE3 (分別編碼骨骼肌電壓門控L-型鈣通道α1亞單位CaV1.1、鈉通道α亞單位NaV1.4和鉀通道輔助亞單位MiRP2)。HypoPP患者具有基因異質(zhì)性，有研究報道HypoPP患者中CACNA1S基因突變最常見[1]。目前，HypoPP的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚。因受人體試驗的倫理學(xué)限制，構(gòu)建動物模型用于研究人類疾病已成為國際趨勢。而99%的小鼠基因與人類基因組同源[2]，目前已成為研究哺乳動物尤其是人類基因功能的最常用且能夠?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)突變的模式生物[3]。因此，我們選擇代表性好、發(fā)病癥狀重的CaV1.1 Arg528His(R528H)突變，運(yùn)用同源重組和胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES細(xì)胞)技術(shù)構(gòu)建了Cchl1a3基因(與人類CACNA1S基因?qū)?yīng))R528H突變的HypoPP敲入小鼠模型，為在整體動物水平研究發(fā)病機(jī)制和病理生理提高良好的平臺。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 打靶載體及實驗動物

Cchlla3-knock-in打靶載體上海南方模式生物研究中心保存；SPF級C57BL/6J雌鼠，體重18～19 g，來自上海南方模式生物研究中心【SCXK(滬)2009-0023】。實驗在上海南方模式生物研究中心屏障動物實驗設(shè)施進(jìn)行【SYXK(滬)2008-0035】，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)基

來源于129S6/SV品系小鼠的ES細(xì)胞由上海南方模式生物研究中心保存。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、G418、Ganciclovoir(均為Gibco BRL公司產(chǎn)品，美國)、LIF(Chemicon公司，美國)、青鏈霉素、胰蛋白酶(均為Sigma公司產(chǎn)品，美國)。

1.1.3 酶及試劑

Wizard Genomic DNA純化試劑盒(Promega公司，美國)；Taq DNA聚合酶，dNTP及限制性內(nèi)切酶(TaKaRa公司，日本)；PCR引物(上海英俊生物技術(shù)有限公司和上海生工生物工程有限公司合成)；瓊脂糖粉(Oxoid公司，英國)；DNA Marker(深圳晶美生物技術(shù)有限公司)。

1.1.4 主要儀器

電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad公司，美國)；顯微注射平臺(Olympus公司，日本)；PCR儀(Eppenddorf AG22331 Hamburg，德國)；DNA測序儀(ABI公司 Prism 377，美國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Cchl1a3-knock-in打靶載體的構(gòu)建

以Cchl1a3基因為模板設(shè)計引物，擴(kuò)增套取同源臂并定向插入到pBR322質(zhì)粒，并利用Red/ET介導(dǎo)的同源重組從含有Cchl1a3基因的細(xì)菌人工染色體中套取包含目的基因的片段。PCR擴(kuò)增含有目的突變的同源臂并將其插入PL451質(zhì)粒的Frt-neo-Frt片段兩側(cè)，再與攜帶Cchl1a3基因的pBR322- Cchl1a3質(zhì)粒經(jīng)同源重組后，在Cchl1a3基因片段內(nèi)實現(xiàn)目的定點(diǎn)突變G→A，并插入neo篩選基因和Flp重組酶特異性識別位點(diǎn)Frt，從而獲得Cchl1a3-knock-in打靶載體。該載體構(gòu)建已在課題組的前期工作中完成[4]。

1.2.2 ES細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化及藥物篩選

取處于對數(shù)生長期的ES細(xì)胞經(jīng)0.125%胰蛋白酶-EDTA消化并計數(shù)，加適量的PBS使細(xì)胞密度達(dá)到約1.5×107/mL。取0.8 mL上述ES細(xì)胞懸液，加入約35 μg經(jīng)Not I線性化的Cchl1a3-knock-in質(zhì)粒DNA，混勻后以電壓為240 V、電容為500 μF的電參數(shù)進(jìn)行電穿孔，電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞重新懸浮后平均分配到3個已鋪好滋養(yǎng)層細(xì)胞10 cm盤培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。電穿孔24 h后換含有選擇藥物G418(300 mg/L)和Ganciclovoir(2 umol/L)的培養(yǎng)液進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，每天更換培養(yǎng)液，8～10 d后可發(fā)現(xiàn)肉眼可見的抗性ES細(xì)胞克隆并進(jìn)行挑取。

1.2.3 PCR法和DNA測序法鑒定同源重組ES細(xì)胞克隆

挑取的ES細(xì)胞克隆經(jīng)消化、吹打后轉(zhuǎn)移至96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，部分凍存，部分用于提取基因組DNA。根據(jù)Cchlla3基因敲入載體構(gòu)建策略(圖1)設(shè)計特異性的PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增篩選獲得的ES細(xì)胞克隆是否發(fā)生雙臂同源重組。其中，5’短臂上游引物P1為5’-TCACGCCACCCCTTCC ATGAACACA-3’(gene site: 39729-39753)，位于5’短臂外；下游引物P2為5’-CCTCCCCCGTGCCT TCCTTGAC-3’，位于neo重組區(qū)域，應(yīng)擴(kuò)增出2340 bp的片段。3’長臂上游引物P3為5’-CTGA GCCCAGAAAGCGAAGGA-3’，位于neo重組區(qū)域；下游引物P4為5’-CCCGTCCCCTTTTGGTGCAT AGTGC-3’ (gene site: 48770-48746)，位于3’長臂外，應(yīng)擴(kuò)增出7511 bp的片段。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。進(jìn)一步對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，明確有無突變。

1.2.4 ES細(xì)胞的囊胚注射及胚胎移植獲得Cchl1a3基因R528H敲入嵌合小鼠并鑒定

囊胚來源于自然受孕并發(fā)育至囊胚階段的C57BL/6J小鼠，將陽性ES細(xì)胞克隆顯微注射到小鼠囊胚中，每枚囊胚中注射15個左右ES細(xì)胞。將注射后囊胚培養(yǎng)于無LIF的DMEM完全培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)1 h左右，再移植到2.5 d假孕母鼠子宮中，每側(cè)移植8～10枚，自然分娩，產(chǎn)下的后代若毛色與ES細(xì)胞來源小鼠(129S6/SVEV灰褐色)相同，說明該鼠是有ES細(xì)胞整合的嵌合體小鼠。對該灰色小鼠經(jīng)提取尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定(鑒定策略同上)，是否攜帶打靶后的突變基因。

1.2.5 Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠的獲得及鑒定

再將嵌合體小鼠與C57BL/6J小鼠交配，獲得雜合子小鼠并與攜帶Flp重組酶的FLP小鼠交配繁育，獲得的子代小鼠可被位點(diǎn)特異性重組切除neo基因和1個Frt位點(diǎn)，為雜合的Cchlla3基因R528H敲入去neo小鼠。用PCR法鑒定子代小鼠是否發(fā)生去neo反應(yīng)。根據(jù)Cchlla3基因敲入去neo小鼠基因組鑒定策略(圖2)設(shè)計特異性的PCR引物。其中，5’短臂上游引物P1同上，下游引物P5為5’-TAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCC-3’，位于重組區(qū)域，產(chǎn)物大小為2116 bp；3‘長臂上游引物P6為5’-CCGGATCCACCTAATAACTTCGTAT-3’，位于重組區(qū)域，下游引物P4同上，產(chǎn)物大小為7165 bp。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。再對PCR產(chǎn)物行DNA序列測定進(jìn)一步證實，其Cchlla3基因突變(G→A)和敲入的基因片段的重組位點(diǎn)是否正確。

圖1 Cchl1a3基因R528H敲入載體的構(gòu)建策略

圖2 Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠基因組鑒定策略

1.2.6 繁殖獲得Cchlla3基因R528H敲入去neo純合小鼠及初步表型分析

Cchlla3基因R528H敲入去neo雜合子小鼠交配得到純合的Cchlla3基因敲入去neo小鼠。然后對這些小鼠進(jìn)行PCR及DNA測序進(jìn)一步確定目的突變是否存在。Cchlla3基因敲入去neo純合子小鼠PCR鑒定的上游引物P7為5’-CGCTTCGACTGCTTCGTGGTGTGC-3’，下游引物P8為5’-CCCGTGTTCATGCCAAAGCTGGGC-3’。純合子小鼠應(yīng)為870 bp的片段，而野生型小鼠應(yīng)為748 bp的片段。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。再對PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序進(jìn)一步證實目的突變是否存在，并對該純合子小鼠的外觀、活動及生長發(fā)育等方面進(jìn)行觀察。

注：m：DNA marker；-：陰性對照；1-9：同源重組 ES細(xì)胞克隆。

2 結(jié)果

2.1 同源重組ES細(xì)胞克隆的篩選及鑒定

將線性化Cchl1a3-knock-in載體電轉(zhuǎn)染到ES細(xì)胞中。經(jīng)過G418和Ganciclovoir篩選培養(yǎng)8 d后發(fā)現(xiàn)并挑取96個藥物抗性ES細(xì)胞克隆，提取其基因組DNA樣本并進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果顯示有9個ES細(xì)胞克隆的5’短臂擴(kuò)增產(chǎn)物長2.3 kb，3’長臂擴(kuò)增產(chǎn)物長7.5 kb，提示雙臂發(fā)生同源重組(圖3)。因突變位點(diǎn)靠近5’短臂，進(jìn)一步對這9個ES細(xì)胞克隆的5’短臂PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，結(jié)果驗證目的突變位點(diǎn)正確，測序結(jié)果(圖4)。

2.2 陽性ES克隆囊胚注射結(jié)果

通過顯微囊胚注射共完成了250枚胚胎，并移植到2.5 d假孕母鼠子宮中，制作了13只受體。假孕母鼠飼養(yǎng)于上海南方模式生物研究中心SPF級動物房，自然分娩，產(chǎn)下15只小鼠。其中7只為嵌合度>50%的嵌合體雄性小鼠，它們的毛色呈灰褐色，與ES細(xì)胞來源的灰褐色129品系小鼠相同，也說明了外源的ES細(xì)胞已整合入生殖細(xì)胞，該嵌合體小鼠是種系嵌合體小鼠(彩插2圖5)。

2.3 Cchl1a3基因R528H敲入去neo雜合小鼠的獲得及鑒定

將嵌合體小鼠與C57BL/6J小鼠交配獲得雜合子小鼠，再將該雜合子小鼠和FLP小鼠交配繁育，獲得15只子代并對其進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示其中9只小鼠(4雄，5雌)發(fā)生了去neo反應(yīng)，即5’短臂擴(kuò)增片段長度為目標(biāo)的2.1 kb，3’長臂擴(kuò)增片段長度為目標(biāo)的7.2 kb。9只小鼠基因組DNA的PCR電泳結(jié)果(圖6)。經(jīng)DNA序列測定也證實了Cchlla3基因突變(G→A)和敲入的基因片段的重組位點(diǎn)是正確的。

2.4 純合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠的獲得及表型分析

將雜合的Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠交配，獲得的子代小鼠中野生型、雜合子和純合子的比例符合孟德爾遺傳定律。對子代小鼠鼠尾基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示15只小鼠的基因組DNA擴(kuò)增片段長度為870 bp，為純合子Cchl1a3基因R528H敲入去neo小鼠，而對照的野生型小鼠DNA擴(kuò)增片段長度為748 bp(圖7)。從這15只小鼠中隨機(jī)抽取5只行DNA序列測定，結(jié)果也證實了該小鼠為攜帶Cchl1a3基因G→A突變的純合子小鼠(彩插2圖8)。純合子小鼠發(fā)育至性成熟時精神、飲食及活動狀態(tài)良好，但是在4個月齡時從背部開始出現(xiàn)脫毛和皮膚破潰，逐漸累及整個軀干，再延伸至頭部及四肢，甚至出現(xiàn)死亡(彩插3圖9)。

注：(a)箭頭標(biāo)記處為目的突變對應(yīng)的反向突變位點(diǎn)C→T；(b)方框標(biāo)記處為目的突變對應(yīng)的反向突變位點(diǎn)C→T。

注：m：DNA marker；1，2，5，6，8，10，12，14，15：同源重組 ES細(xì)胞克隆。

注：m：DNA marker；-：野生型小鼠； 1-15：去neo基因純合子小鼠。

3 討論

Cchlla3基因編碼小鼠骨骼肌L 型電壓依賴型鈣通道的a1亞基，與人類的CACNA1 S基因編碼的氨基酸序列92%相同。在已發(fā)現(xiàn)的HypoPP突變位點(diǎn)中，人類和小鼠的氨基酸也完全相同，顯示了它們在功能上的高度一致性。2008年，Hayward等[5]建立了表達(dá)SCN4A基因Met1592Val突變的小鼠，用于研究高血鉀周期性麻痹(HyperKPP) 的模型。Wu等[6]又構(gòu)建了SCN4A基因R669H突變敲入小鼠，用于研究HypoPP神經(jīng)肌肉電生理的變化，也取得了一定的進(jìn)展。HypoPP患者嚴(yán)重時可因呼吸肌麻痹或低血鉀導(dǎo)致的惡心心律失常而危及生命。據(jù)Jurkat-Rott[7]報道，36個HypoPP家族中有15人死于本病發(fā)作，中位年齡僅22歲。鑒于這是一種危害嚴(yán)重的疾病, 建立與人類HypoPP具有相似遺傳特征的點(diǎn)突變小鼠模型來研究該病的發(fā)病機(jī)制具有極高的價值。

在HypoPP患者已知突變中，CACNA1S基因R528H突變的地域分布最廣，突變頻率最高，具有代表性。因此，在前期工作中我們根據(jù)Liu[8]等和Chan[9]等人的方法，運(yùn)用現(xiàn)在常用的Red/ET重組技術(shù)和Flp-FRT重組酶系統(tǒng)構(gòu)建了Cchl1a3基因R528H突變打靶載體[4]。本研究基于neo(正選擇標(biāo)記基因)和HSV-tk(負(fù)選擇標(biāo)記基因)基因的正負(fù)篩選策略，通過ES細(xì)胞基因打靶獲得9個同源重組克隆，PCR和DNA序列測定均證實Cchl1a3基因內(nèi)實現(xiàn)R528H定點(diǎn)突變并插入篩選基因和重組酶特異性識別位點(diǎn)。同源重組ES細(xì)胞克隆經(jīng)顯微注射、嵌合體育種獲得了低鉀型周期性麻痹相關(guān)的Cchl1a3基因R528H突變純合子敲入小鼠模型，精確模擬CACNA1S基因第11號外顯子上的R528H突變。本研究是國內(nèi)首個成功構(gòu)建的攜帶Cchl1a3基因R528H突變的敲入小鼠模型，不僅可以解決研究材料稀缺、代表性差的問題，還可以避免了在人體實驗材料以及實驗技術(shù)不可操作性的限制。

通過表型觀察到去neo純合子小鼠在性成熟前精神狀態(tài)良好，飲食及活動與正常小鼠無差異，但在4個月齡時逐漸出現(xiàn)脫毛，皮膚破潰甚至死亡。經(jīng)過加強(qiáng)環(huán)境消毒、墊料更換等處理，該純合小鼠的皮膚狀況沒有明顯改善，我們認(rèn)為這可能與該小鼠殘留有部分外源性基因有關(guān)。本研究中，雜合子小鼠與表達(dá)Flp重組酶的小鼠雜交后，攜帶的Frt-neo-Frt篩選基因片段被位點(diǎn)特異性重組切除neo基因和1個Frt位點(diǎn)，以減少對內(nèi)源基因表達(dá)的影響。這是一種去除選擇基因的有效方法，但仍在Cchl1a3基因11內(nèi)含子中殘留122 bp的外源性堿基。目前常用的基因敲入方法尚不能完全避免這種殘留的重組靶點(diǎn)區(qū)[10-11]，但未涉及類似情況。本研究中，F(xiàn)rt-neo-Frt片段位于Cchl1a3基因11內(nèi)含子中，而該內(nèi)含子序列及殘留序列經(jīng)過網(wǎng)上比對發(fā)現(xiàn)并無編碼功能，但也不能完全排除殘留基因?qū)D(zhuǎn)錄后剪切加工的影響。此外，小鼠皮膚潰爛多因循環(huán)障礙和神經(jīng)功能障礙導(dǎo)致，但是因該小鼠數(shù)量的限制，尚未對其進(jìn)行肌肉電生理變化，或是血液指標(biāo)等檢測，我們還需進(jìn)一步研究解釋該現(xiàn)象。

HypoPP患者平時并不發(fā)病，而本研究的純合子小鼠在沒有預(yù)處理的情況下并沒有出現(xiàn)肌肉麻痹、四肢癱瘓等HypoPP的典型表現(xiàn)，與該病患者相一致。目前，HypoPP只在統(tǒng)計學(xué)上與基因突變具有相關(guān)性，但關(guān)于相關(guān)基因突變的功能學(xué)研究甚少，突變導(dǎo)致低血鉀的分子機(jī)制仍不十分清楚。HypoPP患者發(fā)病前常伴有明顯的誘因，如劇烈活動、高碳水化合物飲食、酗灑、寒冷、勞累、上呼吸道感染、大量輸入葡萄糖等。多數(shù)研究認(rèn)為HypoPP患者的發(fā)作主要與胰島素、甲狀腺素、腎上腺素等內(nèi)源性激素水平有關(guān)[12-15]。同時，在以往對HypoPP小鼠模型的研究中，只觀察到突變小鼠在外源的低血鉀環(huán)境下具有HypoPP發(fā)病時的肌肉電生理特征，但并沒有出現(xiàn)自發(fā)性的低血鉀。因該疾病需要在上述條件下誘發(fā)出現(xiàn)低血鉀，本研究中并未對正常情況下的純合小鼠進(jìn)行血鉀的檢測，該部分?jǐn)?shù)據(jù)有待進(jìn)一步補(bǔ)充。此外，我們將在Cchlla3基因R528H突變敲入小鼠模型的基礎(chǔ)上，給予各種激素處理并進(jìn)行表型分析，以期證實該突變小鼠能夠出現(xiàn)自發(fā)性低血鉀等表現(xiàn)，精確模仿人類HypoPP的發(fā)病。這樣不僅可以發(fā)現(xiàn)CACNA1S突變致HypoPP的分子機(jī)制，還可以在CACNA1S功能的基礎(chǔ)研究上有新的突破，為改進(jìn)防治措施和藥物研發(fā)提供基礎(chǔ)。

致謝 本實驗得到海軍總醫(yī)院中心實驗室周麗君研究員的悉心指導(dǎo)和技術(shù)幫助，對此表示感謝。

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