腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染病原和分子診斷

高正琴，賀爭鳴，關(guān)偉鴻

(中國食品藥品檢定研究院，北京 100050)

糞類圓線蟲(Strongyloidesstercoralis)是一種自生和寄生世代交替的兼性寄生蟲，也是一種機(jī)會致病性腸道線蟲。機(jī)體感染后，成蟲寄生于消化道，當(dāng)宿主免疫力正常時，該蟲經(jīng)自身感染方式造成長期寄生可達(dá)數(shù)十年之久而不表現(xiàn)明顯致病癥狀，但當(dāng)宿主免疫功能低下時，幼蟲可侵入肺、肝、腦、腎等器官，引起糞類圓線蟲病(strongyloidiasis)，甚至死亡[1-4]。至今尚未見腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染的報道。本文首次對腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染進(jìn)行了病原和分子診斷?，F(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

腫瘤移植裸鼠(不明原因突發(fā)死亡)來自中國某藥物研究機(jī)構(gòu)。

1.2 病原診斷

將腫瘤移植裸鼠剖檢發(fā)現(xiàn)：結(jié)腸水腫，收集水腫液多達(dá)2 mL。肉眼可見空腸內(nèi)有數(shù)條細(xì)小線蟲在內(nèi)容物中蜿蜒游動。取結(jié)腸水腫液、空腸內(nèi)容物涂片，實(shí)時動態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果。

1.3 二重PCR分子診斷

針對糞類圓線蟲act-2和btub基因設(shè)計引物。SSact-2F：5′-GATTATCGTAGTGAGAGGACGTGTAG AGATAATAAA-3′；SSact-2R：5′-CGGCAACCTCTTC GTCACACATTTTCTATAGCAAGT-3′；片段長度1183 bp。SSbtubF：5′-ATGAGAGAAATTGTTCACGTCCAA ACCGGCCAATGT-3′；SSbtubR:5′-TTTTTTTTTTTTT TTTTTGCAAGATAATAGTTTAAT-3′；片段長度1460 bp。收集腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液、空腸內(nèi)容物中糞類圓線蟲，用德國Qiagen公司的QIAamp DNA Mini Kit試劑盒，按說明書操作抽提DNA。以抽提的DNA為模板，同時用剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲DNA作為糞類圓線蟲二重PCR擴(kuò)增時的陰性對照。PCR總反應(yīng)體系為50 μL，包括10×Buffer (Mg2+ Plus) 5.0 μL、dNTP Mixture 4.0 μL、正反向引物(20 pmol/μL)各1.0 μL、EX Taq(5U/μL)0.5 μL、模板DNA 1 μL、nuclease-free water 37.5 μL。循環(huán)參數(shù)：95℃ 1 min 1；95℃ 15 s，55℃ 15 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min 1個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

2 結(jié)果

2.1 病原學(xué)診斷結(jié)果

2.1.1 腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液涂片鏡檢結(jié)果：采集腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液低速離心，取適量沉淀用生理鹽水直接涂片，實(shí)時動態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果：可見數(shù)條異?；钴S、呈蛇形浮游的線蟲幼蟲，呈C型或反S型，蟲體外觀無色透明，頭端鈍圓，尾部尖細(xì)，長約0.3 mm，具有雙球型咽管(圖1)。依據(jù)蟲體形態(tài)，鑒定為糞類圓線蟲桿狀蚴[5-6]。

圖1 腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液中糞類圓線蟲桿狀蚴

2.1.2 腫瘤移植裸鼠空腸內(nèi)容物涂片鏡檢結(jié)果：取腫瘤移植裸鼠空腸內(nèi)容物，用生理鹽水直接涂片，實(shí)時動態(tài)顯微視頻攝錄結(jié)果：可見大量無色透明、運(yùn)動活潑、呈蛇形游走樣線蟲蟲體，長約2.2 mm，寬0.03 mm，蟲體半透明，體表具細(xì)橫紋，口腔短，咽管細(xì)長，約為體長的1/3(圖2)，尾端尖細(xì)，末端略呈錐形，生殖器官為雙管型，肛門位于距尾端1/3處的腹面(圖3)。依據(jù)蟲體形態(tài)，鑒定為糞類圓線蟲寄生世代雌蟲[5-6]。

圖2 腫瘤移植裸鼠空腸內(nèi)容物中糞類圓線蟲寄生世代雌蟲頭端

圖3 腫瘤移植裸鼠空腸內(nèi)容物中糞類圓線蟲寄生世代雌蟲尾端

2.2 分子生物學(xué)診斷結(jié)果

在糞類圓線蟲感染腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液、空腸內(nèi)容物樣本中均檢測出糞類圓線蟲act-2和btub基因特異性DNA片段(大小分別為1183 bp和1460 bp)，而作為陰性對照的剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲卻未觀察到目的基因片段擴(kuò)增。腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲二重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。糞類圓線蟲二重PCR擴(kuò)增獲得了清晰特異的act-2和btub目的條帶，分子診斷結(jié)果確診了腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染。

注：泳道1-2：糞類圓線蟲感染裸鼠結(jié)腸水腫液樣本act-2基因特異性PCR產(chǎn)物；泳道6-7：糞類圓線蟲感染裸鼠空腸內(nèi)容物樣本btub基因特異性PCR產(chǎn)物；泳道3-5和泳道8-10：陰性對照：剛地弓形蟲、賈第鞭毛蟲、蠕形住腸線蟲。

3 討論

糞類圓線蟲最先由Normand于1876年在越南境內(nèi)一患腹瀉法國士兵的糞便中發(fā)現(xiàn)，而后在尸檢時又在腸道、膽管、胰管中發(fā)現(xiàn)許多線蟲，但形態(tài)與糞便中的蟲體不同。后經(jīng)眾多學(xué)者的不斷研究后認(rèn)為其為同一蟲種的不同發(fā)育階段，并對其生活史及侵入人體的途徑和在人體內(nèi)的移行有了進(jìn)一步的研究。惡性腫瘤、器官移植、造血干細(xì)胞移植、HIV感染、使用皮質(zhì)類固醇藥物增加糞類圓線蟲機(jī)會性感染的風(fēng)險，未及時發(fā)現(xiàn)治療者死亡率較高[7-12]。

本研究首次對腫瘤移植裸鼠糞類圓線蟲感染進(jìn)行了病原和分子診斷。作者首先在腫瘤移植裸鼠結(jié)腸水腫液和和空腸內(nèi)容物直接涂片中發(fā)現(xiàn)了糞類圓線蟲的幼蟲(桿狀蚴)和成蟲(雌蟲)，此類報道實(shí)屬罕見。首次應(yīng)用實(shí)時動態(tài)顯微視頻攝錄技術(shù)跟蹤監(jiān)測寄生蟲，獲得了糞類圓線蟲幼蟲和成蟲典型特征形態(tài)及獨(dú)特運(yùn)動方式的寶貴視頻資料。應(yīng)用二重PCR技術(shù)，從分子水平上對腫瘤移植裸鼠感染的糞類圓線蟲進(jìn)行多基因特征確認(rèn)，為快速準(zhǔn)確鑒別診斷糞類圓線蟲感染提供新的思路。

裸鼠先天性無胸腺，缺乏免疫反應(yīng)，是免疫缺陷動物，類圓線蟲病的發(fā)生可能沒有任何癥狀。本研究中的腫瘤移植裸鼠，可能是因?yàn)槟[瘤的移植加劇了免疫功能的受損，從而激發(fā)了潛在的糞類圓線蟲自體加速傳染擴(kuò)散傳播，也可能是因?yàn)橐浦擦宋廴居屑S類圓線蟲的腫瘤而高度感染。因此，在腫瘤移植手術(shù)前期，一定要對供體腫瘤和受體裸鼠進(jìn)行糞類圓線蟲等病原體篩查檢測，以保障質(zhì)量和安全。

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