上海KM小鼠種子群體遺傳狀況分析

王 洪，杜小燕，徐 平，遲曉麗，李根平，岳秉飛，陳振文

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069；2. 中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；3. 中科院上海生命科學(xué)研究院，上海 201619；4. 北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦公室，北京 100159)

昆明小鼠(KM)是1946年我國(guó)從印度Haffkine研究所將瑞士種小鼠引入云南昆明，1952年由昆明引入北京生物制品研究所，1954年推廣到全國(guó)各地。該小鼠特點(diǎn)是產(chǎn)仔率高、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)，常見(jiàn)的自發(fā)腫瘤為乳腺癌，發(fā)病率約25%。KM小鼠在我國(guó)廣泛應(yīng)用于教學(xué)，生殖生理、腫瘤、毒理、藥理、免疫和微生物的研究以及藥品和生物制品的生產(chǎn)和檢定工作，是使用量最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一[1]。但50多年來(lái)，人們對(duì)KM小鼠的遺傳狀況了解甚少，尤其是對(duì)國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心的封閉群動(dòng)物的群體遺傳結(jié)構(gòu)尚不清楚，使動(dòng)物保種和生產(chǎn)都處于盲目狀態(tài)，給KM小鼠的種子資源安全和應(yīng)用的可靠性帶來(lái)隱患。本研究通過(guò)篩選優(yōu)化出的30個(gè)富含多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)來(lái)源于國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心KM小鼠進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，從而闡明上海分中心KM小鼠的群體遺傳質(zhì)量狀況，為科學(xué)保種和動(dòng)物生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支撐，為建立封閉群小鼠的遺傳檢測(cè)方法和標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣本

在國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心飼養(yǎng)的SPF級(jí)封閉群KM小鼠種群中避開(kāi)同窩個(gè)體隨機(jī)選取30只小鼠，分別取腎臟一個(gè)，放入無(wú)菌EP管中，-20℃冰凍保存?zhèn)溆?。?dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(京)2011-0008。

1.2 樣本DNA的制備

取小鼠腎組織100 mg，加入到含有蛋白酶K的抽提緩沖液中消化過(guò)夜，酚/氯仿法提取DNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度A260/A280值在1.8～2.0之間，樣品合格。取適量稀釋成50 ng/μL～100 ng/μL作為DNA模版，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 微衛(wèi)星位點(diǎn)的選擇

本研究所用30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)從相關(guān)文獻(xiàn)中選取[2-4]，位點(diǎn)的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號(hào)染色體上，且具有較高的多態(tài)性。引物委托英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。序列詳見(jiàn)表1。

1.4 試劑

Taq酶、50 bpDNA marker、dNTP、瓊脂糖均購(gòu)自Takara公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)。

1.5 主要儀器設(shè)備

日本Biospec-mini紫外分光光度計(jì)，Mettler GB303電子天平，Bio-Rad MyCycler型PCR儀，Bio-Rad Model 3000Xi型電泳儀，GelLogic 212PRO 紫外與可見(jiàn)光凝膠分析裝置。

1.6 PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系：總反應(yīng)體系20 μL，其中：10×PCR buffer 2 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1μL，dNTP(100μmol/L) 1.2 μL，鎂離子(1.5 mmlo/L)1.5 μL，Taq 酶(2.5 U/μL)0.2 μL，50 ng～100 ng/μL基因組DNA 1μL，純水(ddH2O) 12.1 μL。

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；退火溫度(54～64)℃(表1)30 s；72℃延伸30 s；35個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸8 min；擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.7 電泳結(jié)果及記錄

2.5%的瓊脂糖凝膠，電壓150 V，時(shí)間30 min。溴化乙啶(2 μg/mL)染色，紫外可見(jiàn)分析裝置記錄拍照。

1.8 STR掃描

擴(kuò)增產(chǎn)物應(yīng)用STR掃描儀進(jìn)行掃描，一次掃描可以同時(shí)掃描三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，三個(gè)位點(diǎn)分別用三種熒光FAM、HEX、TAMRA標(biāo)記，這三個(gè)位點(diǎn)的同一個(gè)小鼠樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按照1：3：5體積比混合后取1 μL上樣，進(jìn)行STR掃描。

由Genemapper V4.0 軟件讀出30個(gè)樣本在30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增片斷大小。每個(gè)位點(diǎn)的等位基因根據(jù)擴(kuò)增片斷大小從大到小順序排列記錄為a、b、c、d等，每個(gè)樣本的基因型即可記錄為aa、ab、ac等形式。

1.9 數(shù)據(jù)處理

群體內(nèi)遺傳變異采用雜合度和多態(tài)性信息含量2個(gè)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。將所有樣本的每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的基因型以aa、ab、ac等形式輸入Popgen1.32軟件。利用軟件計(jì)算不同個(gè)體在各微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率、平均有效等位基因數(shù)(Ne)、平均雜合度(H)；利用Littleprogram 0.6計(jì)算各位點(diǎn)的多態(tài)性信息含量(PIC)。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果

A圖為D14Mit3位點(diǎn)在1-10號(hào)小鼠中的結(jié)果；，B圖為D11Mit4位點(diǎn)在1-10號(hào)小鼠中的結(jié)果；C圖為D15Mit5位點(diǎn)在11-30號(hào)小鼠中的結(jié)果。

A圖為D1Mit365位點(diǎn)。B圖為D8Mit33位點(diǎn)。C圖為D4Mit235位點(diǎn)?？v坐標(biāo)為波峰高度，橫坐標(biāo)為掃描時(shí)間。

圖3 D11Mit4位點(diǎn)的STR掃描圖?？v坐標(biāo)為波峰高度，橫坐標(biāo)為掃描時(shí)間

擴(kuò)增結(jié)果以D14Mit3 和D15Mit5兩個(gè)位點(diǎn)為例，仔細(xì)觀察，肉眼可見(jiàn)條帶細(xì)微差別，條帶的不均一性提示可選用作STR掃描，有利于篩選多態(tài)性位點(diǎn)。如圖1所顯示的是位點(diǎn)D14Mit3 和D15Mit5在不同個(gè)體小鼠樣本的PCR結(jié)果電泳圖。其中圖1A是D14Mit3 位點(diǎn)在1～10號(hào)小鼠樣本的PCR結(jié)果電泳圖，圖1B所顯示的是D15Mit5位點(diǎn)的1～10號(hào)小鼠樣本的PCR結(jié)果電泳圖,圖1C所顯示的是D15Mit5位點(diǎn)的11～30號(hào)小鼠樣本的PCR結(jié)果電泳圖。

2.2 STR掃描結(jié)果

經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳初篩，將肉眼可見(jiàn)差別的位點(diǎn)進(jìn)行STR掃描，得到多態(tài)性較高的STR掃描圖譜。30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)引物對(duì)30只KM小鼠樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)STR掃描，結(jié)果都出現(xiàn)了典型的波形。以D1Mit365, D4Mit235, D8Mit33和D11Mit4為例，分別示意不同峰型及判讀方法。STR掃描可以精確檢測(cè)到DNA片段的具體長(zhǎng)度，區(qū)分相差僅為1 bp的DNA片段。圖2所顯示的是第 1號(hào)小鼠樣本，在D1Mit365、 D4Mit235、D8Mit33三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)STR掃描后的圖形。其中1號(hào)樣本在D8Mit33位點(diǎn)(圖2-B)只有一個(gè)獨(dú)立的單峰，說(shuō)明樣本在該位點(diǎn)為純合子，1號(hào)小鼠樣本，在D1Mit365(圖2-A)、D4Mit235(圖2-C)和D11Mit4(圖3)位點(diǎn)有兩個(gè)獨(dú)立的尖峰，說(shuō)明是雜合子。

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

封閉群KM小鼠在30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)介于2～9個(gè)之間，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)見(jiàn)表1。該小鼠群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為4.1000，平均有效等位基因數(shù)為2.3989，平均雜合度為0.5342，平均多態(tài)性信息含量為0.4735。高度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC>0.5)有15個(gè)，中度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC<0.5)有13個(gè)，低度多態(tài)性位點(diǎn)(PIC<0.25)有2個(gè)(見(jiàn)表2)。

2.4 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

利用Popgene 1.32，計(jì)算KM小鼠30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的P值。結(jié)果有13個(gè)位點(diǎn)顯著偏離Hardy-Weinberg平衡，17個(gè)位點(diǎn)群體處于Hardy-Weinberg平衡，各位點(diǎn)P值見(jiàn)表2。

表1 30個(gè)微衛(wèi)星座位的擴(kuò)增條件、等位基因數(shù)及等位基因分布

表2 封閉群KM小鼠在30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的基因頻率、平均雜合度、多態(tài)性信息含量

3 討論

目前國(guó)內(nèi)嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中推薦的遺傳檢測(cè)方法為生化標(biāo)記檢測(cè)法，且僅限于近交系大小鼠的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)。而封閉群實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的遺傳質(zhì)量控制雖然有標(biāo)準(zhǔn)，但主要是對(duì)其引種和繁殖方式進(jìn)行了限定，尚未建立統(tǒng)一的遺傳檢測(cè)方法。封閉群小鼠是應(yīng)用最為廣泛和使用數(shù)量最多的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心負(fù)責(zé)對(duì)國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)單位提供種子動(dòng)物，因此其種群的遺傳質(zhì)量將直接關(guān)系到我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量，關(guān)系到醫(yī)學(xué)研究和藥物評(píng)價(jià)中動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。本研究通過(guò)優(yōu)選小鼠微衛(wèi)星位點(diǎn)，建立了針對(duì)封閉群小鼠的微衛(wèi)星DNA遺傳檢測(cè)方法，并利用該方法對(duì)國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心的KM小鼠種子群體進(jìn)行了遺傳結(jié)構(gòu)分析，這在國(guó)內(nèi)尚屬首次。本研究結(jié)果不但建立了能有效評(píng)估封閉群小鼠的遺傳檢測(cè)方法，明確了我國(guó)KM小鼠種子群體的遺傳狀況，而且為豐富和完善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳質(zhì)量檢測(cè)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提供了數(shù)據(jù)支撐。

對(duì)于群體遺傳多樣性的評(píng)價(jià)，其可靠性主要取決于所用樣本對(duì)總體的代表性和遺傳標(biāo)記對(duì)基因組的代表性。關(guān)于樣本量，Barker(1994)提出每個(gè)品種至少分析25個(gè)樣本[5]。本研究以從國(guó)家嚙齒類(lèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種子中心上海分中心多年飼養(yǎng)的封閉群KM小鼠種群中避開(kāi)同窩個(gè)體隨機(jī)選取30只小鼠為研究對(duì)象，因而取樣方式和取樣數(shù)量都使得所取樣本能很好地代表總體。遺傳標(biāo)記對(duì)基因組的代表性取決于標(biāo)記物的數(shù)量、在染色體上的分布和標(biāo)記的多態(tài)性，Barker(1994)建議，在群體遺傳分析時(shí)所用微衛(wèi)星數(shù)目不應(yīng)該低于25個(gè)，而且彼此不連鎖，每個(gè)標(biāo)記座位上至少有4個(gè)等位基因[5]。本實(shí)驗(yàn)采用30個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，分布于小鼠的1～20號(hào)染色體上，是以多態(tài)性豐富為原則從文獻(xiàn)中優(yōu)選，保證了標(biāo)記物對(duì)基因組的代表性，因此研究結(jié)果具有可靠性。

有效等位基因數(shù)是指在理想群體中(所有等位基因頻率相等)，一個(gè)基因座上產(chǎn)生與實(shí)際群體中相同的純合度所需的等位基因數(shù)。有效等位基因數(shù)是反映群體遺傳變異大小的一個(gè)指標(biāo)，其數(shù)值越接近所檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)，表明等位基因在群體中分布越均勻[6]，同時(shí)就越能較好的反映基因組的實(shí)際情況。本實(shí)驗(yàn)中，KM小鼠群體平均觀測(cè)等位基因數(shù)為4.1，有效等位基因數(shù)平均數(shù)為2.3989，群體的觀測(cè)等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)有偏差，說(shuō)明所檢測(cè)的基因位點(diǎn)的等位基因在群體的基因組中分布還不夠均勻。封閉群動(dòng)物是經(jīng)過(guò)人為定向培育，群體的遺傳多樣性和遺傳平衡難免被打破，這可能是導(dǎo)致觀測(cè)等位基因數(shù)與有效等位基因數(shù)有偏差的原因之一。群體雜合度表示在被檢測(cè)的位點(diǎn)上群體中的雜合子頻率，它是反映群體雜合程度的度量單位，群體平均雜合度的高低反映了群體遺傳的一致性程度，群體雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越大，群體遺傳多樣越高[6 ]。一個(gè)好的封閉群其平均雜合度在0.5～0.7，本實(shí)驗(yàn)中KM小鼠群體平均雜合度為0.5342，符合封閉群遺傳結(jié)構(gòu)特征。除上述參數(shù)外，多態(tài)信息含量(PIC)也是衡量群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)[7]。一般情況下，多態(tài)信息含量能反映出某一個(gè)遺傳標(biāo)記位點(diǎn)所包含的或所能夠提供的遺傳信息的容量。當(dāng)PIC>0.5時(shí)，標(biāo)記具有高度的可提供信息含量，可進(jìn)行連鎖分析，該位點(diǎn)為高度多態(tài)性位點(diǎn)；當(dāng)0.25

Hardy-Weinberg平衡定律是指在一個(gè)群體無(wú)限大，個(gè)體間進(jìn)行隨機(jī)交配、沒(méi)有突變、選擇、遺傳漂變的情況下，群體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率將世代保持不變，處于遺傳平衡狀態(tài)。Hardy-Weinberg檢測(cè)中，當(dāng)P(HWE)>0.05，說(shuō)明在該位點(diǎn)在群體中處于Hardy-Weinberg平衡；當(dāng)0.01

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