胰島素抵抗動脈粥樣硬化小型豬模型的研究

馬毅超，潘永明，陳 亮，陳方明，楊濤濤，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州 310053)

隨著社會經(jīng)濟的高速發(fā)展，近年來我國糖尿病的發(fā)病率呈流行、上升趨勢；據(jù)報道，我國成年人糖尿病的患病率高達11.6%，約1.14億人，幾乎占據(jù)了全世界總患病人數(shù)的一半，糖尿病的治療與防治已成為我國的重大公共衛(wèi)生問題之一，研究還表明，我國每年以胰島素抵抗為發(fā)病基礎(chǔ)的2型糖尿病的發(fā)病率以12%的增長率顯著上升，且是患者致殘致死的重要因素[1]。同時，已有研究證實，2型糖尿病致死的主要原因可能與其伴隨發(fā)生嚴重的動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)有關(guān)[2]。因此，建立理想的胰島素抵抗動脈粥樣硬化疾病動物模型對于促進2型糖尿病病因或疾病機制的研究具有重要意義。

目前，糖尿病動脈粥樣硬化模型的建立大多采用轉(zhuǎn)基因小鼠或大鼠進行，但單基因敲除的動物和鼠類對高脂具有抗性，很難形成AS等特點，使其不能完全模擬人類疾病多基因作用的發(fā)病特點和動脈粥樣硬化的程度不高等缺點[3]。因此，尋找和篩選理想的實驗動物并建立相應(yīng)的動物模型，對于發(fā)病機制和臨床前藥物的評價研究具有重要的支撐作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，小型豬的心臟大小和冠脈循環(huán)與人類相似，特別適合運用于心血管疾病方面的研究[4]。中國小型豬資源豐富，包括有藏豬、五指山小型豬、巴馬小型豬、貴州香豬等；本研究團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，藏豬[Susscrofa]高脂誘導(dǎo)后發(fā)生血管脂質(zhì)沉積同時出現(xiàn)高血壓和糖耐量異?，F(xiàn)象，是一種建立胰島素抵抗AS模型的理想的實驗動物。為此，本研究通過觀察高脂誘導(dǎo)后藏豬的糖脂代謝和胰島素敏感性的變化，探討藏豬胰島素抵抗AS模型的病癥特點。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級4 ～ 5月齡雄性藏豬，體重為12 ～ 16 kg，12只，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供【SCXK(粵)2011-0015】；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心普通級小型豬實驗室[SYXK(浙)2008-0116]，環(huán)境溫度：22±1℃，相對濕度：40% ～ 65%，自由飲水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 儀器與試劑

日立7020型全自動生化儀(日本日立公司)、Nikon生物倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、冰凍切片機(德國Leica公司)、自動染色機(德國Leica公司)、大動物無創(chuàng)生物信號遙測系統(tǒng)(法國EMKA公司)、50%葡萄糖注射液，購自上海信宜金朱藥業(yè)有限公司，高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、總膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、血糖(GLu)果糖胺(FMN)試劑盒購自購自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司，豬胰島素ELISA試劑盒、血清胰島素試劑盒購自上海信然有限公司。

1.3 動物分組及AS模型的建立

藏豬適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察后，行前腔靜脈穿刺取血，測定血液生化和血常規(guī)等各項指標(biāo)無異常者后，開始正式實驗。將藏豬按其體重和糖脂代謝水平分成正常對照組和AS模型組，正常對照組4只，AS模型組8只，正常對照組飼喂基礎(chǔ)飼料，AS模型組飼喂高脂飼料(高脂飼料配方：1.5%膽固醇、15%油脂、10%蛋黃粉、0.5%食鹽、73%基礎(chǔ)飼料)，各組均按體重2.5%飼喂飼料，每2周稱重調(diào)整飼喂量，連續(xù)造模24周后處死，行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.4 指標(biāo)觀察

1.4.1 血液生化指標(biāo)檢測 分別在造模前(0周)、造模后2、4、8、12、16、20、24周時，禁食12 h后，取前腔靜脈血2 mL，3000 r/min離心10 min，分離血清，測定TG、CHOL、HDL-C、LDL-C、并計算動脈粥樣硬化指數(shù)AI，AI=(總膽固醇-高密度脂蛋白)/高密度脂蛋白。同樣方法測定第4、8、12、16、20、24周時FMN、Glu含量和血清胰島素(Ins)含量。

1.4.2 糖耐量試驗 分別在造模后8周、16周、20周、24周時進行糖耐量試驗。各組藏豬禁食16 h后，取耳緣靜脈血1 mL，隨后從耳緣靜脈注射50%葡萄糖注射液，注射量為1 mL/kg，2 min內(nèi)注射完畢，檢測給糖前(0 min)、給糖后15、30、60、90和120 min時的血糖變化，并計算血糖曲線下面積(AUC)，AUC=1/8×BG (0 min) +1/4×BG(15 min)+3/8×BG(30 min)+1/2×BG(60 min)+1/2×BG(90 min)+1/4×BG(120 min)。

1.4.3 胰島素抵抗特性評價 利用穩(wěn)態(tài)模型評價(HOMA)指數(shù)中的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA- IR)和胰島β細胞功能指數(shù)(HOMA-IS)，評價動物胰島素抵抗情況。計算公式為HOMA-IR=FPG(空腹血糖)×FINS(空腹胰島素)/22.5，HOMA-IS=1/FPG×FINS。

1.4.4 動脈血壓及左心室功能的測定 造模24周后，耳緣靜脈注射1 mL/kg 3 %戊巴比妥鈉溶液麻醉動物，行股動脈分離術(shù)，分離股動脈并導(dǎo)管插管，連接血壓換能器，在EMKA大動物無創(chuàng)生理信號遙測系統(tǒng)監(jiān)測藏豬血壓的變化，并記錄舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)和平均動脈壓(MBP)以及心率(HR)、左心室壓(LVSP)、左室最大變化速率(±dp/dtmax)、左室舒張期末壓(LVEDP)。

注：與正常對照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

1.4.5 腹主動脈大體觀察和病理組織學(xué)觀察

造模結(jié)束后，處死藏豬，取腹主動脈、冠狀動脈、頸動脈，觀察動脈脂質(zhì)沉積和斑塊形成情況，并行油紅“O”染色，觀察動脈病變程度。腹主動脈血管進行冰凍切片成4 mm的薄片，HE染色，顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 高脂誘導(dǎo)后藏豬空腹血糖和果糖胺的變化

高脂誘導(dǎo)后，AS模型組藏豬的空腹血糖從第8周開始高于正常對照組，并在造模后第16～24周時顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)。另外，AS模型組藏豬空腹果糖胺含量從第4周開始就發(fā)生顯著性升高，并在整個造模期間內(nèi)均顯著高于正常組(P< 0.01)。(圖1)。

2.2 高脂誘導(dǎo)后藏豬模型糖耐量試驗結(jié)果

高脂誘導(dǎo)后進行葡萄糖耐量試驗發(fā)現(xiàn)，造模8周后AS型組藏豬耳緣靜脈注射葡萄糖2 h后血糖仍顯著高于正常對照組(P< 0.05)，并且糖耐量曲線面積略高于正常對照組(P> 0.05)。同時，AS模型組藏豬造模16 ～ 24周時糖耐量曲線下面積逐漸增高并顯著高于正常對照組(P< 0.05，P< 0.01)；且在造模第24周時AS模型組藏豬在15～90 min時血糖均顯著高于正常對照組(P< 0.05，P< 0.01)(表1)。

2.3 高脂誘導(dǎo)后藏豬HOMA-IR和HOMA-IS指數(shù)的變化

高脂誘導(dǎo)后，AS模型組藏豬HOMA-IR指數(shù)在造模4周開始出現(xiàn)升高，并在造模第16～24周時升高顯著(P< 0.05，P< 0.01)，而HOMA-IS指數(shù)則在造模4后開始降低，并在造模后第20～24周時顯著低于正常組(P< 0.05)(圖2)。

2.4 高脂誘導(dǎo)后藏豬血脂水平和AI指數(shù)的變化

高脂誘導(dǎo)后，藏豬AS模型組血清CHOL、HDL-C和LDL-C水平均從造模第2～24周時均顯著高于正常對照組(P< 0.01)并在第4周達到高峰值，而TG水平在造模過程中與正常對照組無明顯差異(P>0.05)(圖3)。另外，高脂誘導(dǎo)后AS模型組在造模期間AI指數(shù)均顯著高于正常對照組，其中造模第4～24周時差異顯著(P<0.05，P<0.01)(表2)。

表1 造模期間藏豬糖耐量試驗結(jié)果(mmol/L)

注：與正常對照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

注：與正常對照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

表2 造模期間藏豬AI指數(shù)檢測結(jié)果

Tab.2 The results of Tibetan pig AI index during modeling

注：與正常對照組比，*P < 0.05，**P < 0.01。

表4 藏豬左心室功能指標(biāo)的測定結(jié)果

2.5 高脂誘導(dǎo)24周后藏豬的血壓和左心室功能指標(biāo)

造模24周后，AS模型組的藏豬MBP和SBP均顯著升高(P< 0.05，P< 0.01)，DBP有升高趨勢，但無顯著性差異(P> 0.05)(表3)。AS模型組左心室功能指標(biāo)發(fā)生顯著性變化，LVEDP、dPdt+、dPdt-與正常組相比均有顯著性差異(P< 0.05，P< 0.01),AS模型組的HR也有上升趨勢，但無顯著性差異(P> 0.05).

2.6 藏豬動脈血管大體觀察和病理組織學(xué)觀察結(jié)果

造模24周后處死動物，觀察腹主動脈、冠狀動脈及頸動脈脂質(zhì)沉積和粥樣硬化情況。結(jié)果顯示藏豬AS模型組除頸動脈外，冠脈和腹主動脈均發(fā)生較明顯的脂質(zhì)沉積和粥樣硬化，其中腹主動脈粥樣硬化程度更為嚴重。大體觀察和油紅“O”染色顯示，正常對照組腹主動脈內(nèi)皮光滑，無紅色脂質(zhì)條紋沉積；AS模型組腹主動脈出現(xiàn)黃白色脂類物質(zhì)的沉積，并出現(xiàn)明顯的紅色脂質(zhì)條紋染色，沉積嚴重者厚度達1 cm。HE染色結(jié)果顯示，正常對照組腹主動脈內(nèi)膜光滑，無明顯增厚和炎性細胞浸潤，平滑肌排列整齊；AS模型組腹主動脈內(nèi)膜增厚，有皺褶，出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤和聚集，平滑肌排列紊亂(彩插7圖4)。

3 討論

臨床上，胰島素抵抗主要表現(xiàn)為以肥胖、血糖升高、血脂紊亂、糖耐量異常、高血壓為特點的代謝綜合征[5]。本實驗中，我們觀察了高脂誘導(dǎo)下藏豬在造模24周中不同時間點空腹血糖、果糖胺、血脂和糖耐量的變化。圖1的結(jié)果顯示，正常對照組和AS模型組在造模初期空腹血糖值較高，這可能與造模初期藏豬年齡較小在抓取過程中易產(chǎn)生應(yīng)激有關(guān)。在造模中后期，藏豬年齡增大，適應(yīng)了取血環(huán)境，應(yīng)激變小，正常對照組血糖降至正常水平，反觀AS模型組藏豬血糖仍處于較高水平并顯著高于對照組(P< 0.05，P< 0.01),說明高脂誘導(dǎo)后，藏豬出現(xiàn)了血糖升高的現(xiàn)象。為進一步確定藏豬血糖的控制狀況，本實驗還測定了24周中藏豬的FMN的變化情況，F(xiàn)MN的測定被認為是一項簡便、快速并能準(zhǔn)確反映糖尿病血糖控制的指標(biāo)。實驗發(fā)現(xiàn)AS模型組的FMN從第4周開始就發(fā)生顯著升高(P< 0.01),此外AS模型組藏豬的糖耐量亦發(fā)生明顯的異常糖耐量曲線下面積顯著升高，呈現(xiàn)出胰島素抵抗的特征。

為進一步評價模型胰島素抵抗的程度，我們采用了Matthews等[6]提出的穩(wěn)態(tài)模型(HOMA)來測定動物的胰島素β細胞分泌指數(shù)，其中胰島β細胞分泌指數(shù)還可以反應(yīng)動物對胰島素的敏感性，此法簡單實用，是評價胰島素抵抗的金標(biāo)準(zhǔn)方法。結(jié)果顯示，高脂誘導(dǎo)后藏豬的HOMA-IR指數(shù)的水平上升并在造模后期明顯高于正常對照組，同時模型組HOMA-IS指數(shù)并不增高，后期顯著低于正常對照組。綜合糖耐量、血脂和HOMA指數(shù)的結(jié)果，高脂誘導(dǎo)藏豬可能發(fā)生明顯的胰島素抵抗并伴有胰島β細胞的功能障礙。另外，AS模型組藏豬血壓發(fā)生了顯著性升高，這可能也與其血清胰島素水平較高并發(fā)生了胰島素抵抗有關(guān)。研究表明，胰島素抵抗后血清胰島素升高，易發(fā)生高胰島素血癥，高胰島素會通過不同的方式促進血壓的上升，如促進交感神經(jīng)活動增強，促進血管緊張素Ⅱ的分泌，引起血管平滑肌增生、遷移等[7-8]。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，高脂誘導(dǎo)后，血脂發(fā)生了明顯異常。AS模型組的藏豬血清CHOL、HDL-C、LDL-C的含量從造模第2周后已顯著高于正常對照組并在第4周達到高峰值，說明藏豬對高脂飼料十分敏感。研究發(fā)現(xiàn)，血液中的CHOL升高后易造成血管壁增厚使白細胞不易通過，無法去殺細菌，同時大量CHOL還會沉積在血管壁造成血液循環(huán)不良，嚴重時還會發(fā)生血管破裂，形成動脈硬化[9]。高脂模型組的動脈硬化指數(shù)上升符合這一說法，但高脂組模型AI在最后一周較正常對照組并沒有顯著升高，但從解剖結(jié)果來看，藏豬動脈已發(fā)生了較嚴重的粥樣硬化，這可能與飼養(yǎng)時間長使動物適應(yīng)了高脂飼料以及動物自身生長需要對脂質(zhì)的吸收轉(zhuǎn)化為能量供應(yīng)需求，從而導(dǎo)致血清CHOL有所下降有關(guān)。值得一提的是，AS模型組的血清HDL/C和LDL/C的在第4周達到高峰值后便呈現(xiàn)先下降趨勢，其中LDL/C下降較為明顯，其原因可能有以下兩個方面：一是，在第4周后，藏豬逐步從高脂血癥像動脈粥樣硬化炎癥發(fā)展，藏豬食欲下降，高脂飼料攝入量逐月遞減，導(dǎo)致血清CHOL相應(yīng)下降，而LDL/C在脂蛋白中所占比例較大，HDL/C則較小，由于造模時間短，AS的形成較臨床上更快，故CHOL的下降首先直接導(dǎo)致了LDL/C的下降。二是，有研究表明，動脈粥樣硬化斑塊中的脂質(zhì)沉積主要為LDL/C[10]，同樣因為造模時間短的原因，在造模中后期，血管壁上LDL/C積極沉積，導(dǎo)致了血清LDL/C的下降。心臟血流動力學(xué)的指標(biāo)中，AS模型組藏豬的LVEDP發(fā)生了極顯著的升高，LVEDP的上升說明了藏豬的左心室前負荷增加；±dp/dtmax的增高也說明了心臟收縮性能的增強[11]，心臟泵血增強，也從側(cè)面反映了血管可能出現(xiàn)硬化，導(dǎo)致血流不暢。

高脂誘導(dǎo)藏豬發(fā)生胰島素抵抗的同時出現(xiàn)了較為明顯的動脈粥樣硬化的病變，這與臨床上報道的2型糖尿病患者有很強的致動脈粥樣硬化趨勢相符[12]。徐雷等[13]研究發(fā)現(xiàn)，使用高脂飼喂糖尿病模型GK大鼠后，并未出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化；其他一些學(xué)者使用小鼠進行造模時，雖然能夠出現(xiàn)胰島素抵抗的癥狀但都不易發(fā)生動脈粥樣硬化，HDL-C也偏高。另外使用小鼠模型時還存在難以反復(fù)采血和動脈血管的切開的問題[14-15]。而本試驗使用高脂誘導(dǎo)藏豬模型很好的解決了這些問題，AS模型組的藏豬動脈粥樣硬化斑塊明顯，HE染色出現(xiàn)平滑肌增生，排列不規(guī)則，出現(xiàn)典型粥樣硬化的病理變化。

綜上所述，本研究采用高脂誘導(dǎo)建立的藏豬胰島素抵抗動脈粥樣硬化模型，主動脈脂質(zhì)沉積和粥樣硬化程度明顯，并伴有明顯的高血壓、高血脂、糖耐量異常等胰島素抵抗的代謝綜合征，各項指標(biāo)較其它模型更符合臨床表現(xiàn)，是一種研究胰島素抵抗動脈粥樣硬化的理想的模型。

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