近交系小鼠酒精性脂肪肝模型建立的分析

白云峰，李曉娟，李永綱，王立福，王睿林，李 蓓，李瑞生

(1.解放軍第302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合肝病診療與研究中心，北京 100039；2.解放軍第302醫(yī)院實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究保障中心，北京 100039)

近年來(lái)酒精性肝病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，酒精性脂肪肝作為酒精性肝病的前期病變，屬于一種可逆轉(zhuǎn)的良性肝臟疾患[1]。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酒精性脂肪肝的研究非常關(guān)注，但其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，因此建立穩(wěn)定可靠、簡(jiǎn)單易行的動(dòng)物模型對(duì)研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制尤為重要。小鼠因其體型小、操作簡(jiǎn)便，而成為復(fù)制模型較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但小鼠的品種品系較多，大量研究者[2-5]在使用不同品系小鼠復(fù)制酒精性脂肪肝模型時(shí)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果又盡相同。因此，本實(shí)驗(yàn)選取BALB/c、C57和C3H三種常用的近交系小鼠，采用酒精灌胃法復(fù)制酒精性脂肪肝模型，并對(duì)其血清生化指標(biāo)和病理學(xué)改變進(jìn)行綜合對(duì)比分析，以期從中選擇一種最佳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)建立酒精性脂肪肝模型，為今后研究酒精性脂肪肝疾病及其發(fā)病機(jī)制提供良好的實(shí)驗(yàn)保障。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇近交系BALB/c、C57和C3H小鼠，均為SPF級(jí)，雄性，各20只，單鼠體質(zhì)量為20～22 g，BALB/c小鼠和C57小鼠來(lái)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0004】，C3H小鼠來(lái)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證【SCXK(京)2011-0009】。本實(shí)驗(yàn)室具有SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證【SYXK(軍)2012-0010】。

1.2 試劑及飼料

乙醇(分析純，純度>99.7%)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20130315)；生理鹽水(解放軍第302醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：130527405，石家莊四藥有限公司)；小鼠飼料(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼料室)，生產(chǎn)許可證【SCXK(軍)2012-0003】。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備

各品系小鼠均在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)屏障環(huán)境內(nèi)飼養(yǎng)，動(dòng)物自由飲水采食，3 d后將各品系小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=10)和模型組(n=10)。造模方法：各組小鼠每日給予50%乙醇灌胃，灌胃量為12 mL/(kg·bw)，折合乙醇的劑量為4.8 g/(kg·bw)[6]，持續(xù)30 d，小鼠正常飲水采食鼠蛋料。對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

造模過(guò)程中每天觀察各組小鼠精神狀態(tài)和活動(dòng)情況，每周稱(chēng)重一次，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天禁食12 h，次日稱(chēng)重后經(jīng)小鼠眶后靜脈叢采集血液，離心取血清，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)各組小鼠血清生化指標(biāo)：天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和甘油三酯(TG)。采集各組小鼠的肝臟稱(chēng)重，計(jì)算其肝指數(shù)=肝臟重量(g)/小鼠體重(g)×100%，然后將所有采集的肝組織用10%的甲醛固定、脫水、包埋、切片和HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察分析各組小鼠肝臟的組織病理學(xué)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)處理

各組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 各品系間小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)的對(duì)比分析

通過(guò)對(duì)三種近交系小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)的對(duì)比分析：BALB/c模型組體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)均明顯小于對(duì)照組(P< 0.01，P< 0.05)；C57模型組體重增長(zhǎng)量小于對(duì)照組(P< 0.05)，肝指數(shù)不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C3H模型組體重增長(zhǎng)量小于對(duì)照組(P< 0.01)，肝指數(shù)也不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.2 各品系間小鼠血清生化指標(biāo)的對(duì)比分析

通過(guò)對(duì)三種近交系小鼠血清生化指標(biāo)的檢測(cè)分析：BALB/c模型組ALT、AST與對(duì)照組相比均顯著升高(P< 0.01)；C57模型組ALT、AST、TG與對(duì)照組相比均顯著升高(P< 0.01)；C3H模型組與對(duì)照組的ALT、AST、TG之間不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表1 三種近交系小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)的對(duì)比分析

表2 三種近交系小鼠血清生化指標(biāo)的對(duì)比分析

2.3 各品系間小鼠肝組織病理學(xué)的分析

各對(duì)照組小鼠的肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)完整，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞胞漿均勻，無(wú)脂肪空洞和炎性浸潤(rùn)。BALB/c模型組小鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)中出現(xiàn)大量散在的脂肪滴，脂肪變性明顯；而C57模型組小鼠肝細(xì)胞的胞質(zhì)中脂肪滴更多，明顯多于BALB/c小鼠，而且脂滴融合成空泡，空泡又融合成較大的囊泡結(jié)構(gòu)，匯管區(qū)出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，BALB/c和C57模型組均還未出現(xiàn)肝纖維化病變；C3H組小鼠肝臟組織幾乎不存在脂肪空泡，脂肪變不明顯(彩插6圖1)。

3 討論

酒精性肝病是由于長(zhǎng)期大量飲酒所致的肝臟疾病，最初表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而可發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化。由于酒精性脂肪肝為可逆病變，因此研究酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制和預(yù)防措施顯得尤為重要。國(guó)內(nèi)外研究者[7-9]為了闡明乙醇在體內(nèi)所導(dǎo)致肝臟損傷的發(fā)病機(jī)制，采用小鼠、大鼠、家兔和犬等動(dòng)物來(lái)復(fù)制酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，但小鼠因其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)成為最佳的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其中近交系BALB/c小鼠和C57小鼠最為常用。聶嬌等[10]利用C57小鼠對(duì)內(nèi)毒素在酒精性脂肪肝形成過(guò)程中的作用進(jìn)行了相關(guān)研究；Sung等[11]也利用C57小鼠探索了IL-22由于具有抗氧化、抗凋亡、抗脂肪變的作用而對(duì)酒精性肝損傷具有改善作用。而廖彩佶等[12]則研究表明骨髓源性肝干細(xì)胞對(duì)BALB/c小鼠酒精性肝纖維化病變結(jié)構(gòu)和功能具有改善作用。但目前有關(guān)不同品種品系動(dòng)物所建立的酒精性脂肪肝模型對(duì)于其研究結(jié)果是否存在差異還未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)選取BALB/c、C57和C3H小鼠來(lái)建立酒精性脂肪肝模型，通過(guò)對(duì)三種近交系小鼠體重增長(zhǎng)量和肝指數(shù)的對(duì)比分析，其模型組體重增長(zhǎng)量均明顯小于對(duì)照組，說(shuō)明長(zhǎng)期酒精灌胃對(duì)小鼠的體重增長(zhǎng)有影響，因此小鼠在造模過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)身體逐漸瘦弱的現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)BALB/c模型組3只動(dòng)物死亡，C3H模型組1只死亡的現(xiàn)象，可能是由于小鼠對(duì)酒精的耐受力不同以及酒精的毒性造成的死亡。而C57模型組未見(jiàn)死亡，說(shuō)明C57小鼠對(duì)酒精的耐受性相對(duì)較強(qiáng)。在酒精性脂肪肝造模過(guò)程中，自由基、酶及脂質(zhì)過(guò)氧化等在此過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，其中ALT和AST是肝細(xì)胞損傷最敏感的指標(biāo)之一[13-14]。本實(shí)驗(yàn)中BALB/c和C57模型組ALT、AST與對(duì)照組相比均顯著升高(P< 0.01)，符合轉(zhuǎn)氨酶升高的基本特點(diǎn)，另外，C57模型組的TG與對(duì)照組相比也存在明顯的升高現(xiàn)象(P< 0.01)，而C3H組的生化指標(biāo)無(wú)差異。在病理學(xué)檢測(cè)中C57模型組小鼠肝細(xì)胞脂肪滴明顯多于BALB/c和C3H組，而且脂滴已經(jīng)融合成囊泡結(jié)構(gòu)，說(shuō)明了C57模型組小鼠的脂肪病變最明顯，表明C57是復(fù)制酒精性脂肪肝模型最理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這與Petrasek[15]、Tan[16]等選擇C57小鼠進(jìn)行酒精性脂肪肝疾病研究的理念基本一致。

綜上所述，利用三種不同品系的小鼠可建立酒精性脂肪肝動(dòng)物模型，但通過(guò)對(duì)其模型動(dòng)物的體質(zhì)量、肝指數(shù)、血清生化和組織病理學(xué)結(jié)果的綜合分析，證實(shí)了C57小鼠成為復(fù)制酒精性脂肪肝模型較為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，這也為今后如何選擇實(shí)驗(yàn)動(dòng)物建立酒精性脂肪肝模型提供了理論參考，也為進(jìn)一步研究酒精性脂肪肝疾病的發(fā)病機(jī)制、篩選最佳的臨床預(yù)防和治療藥物提供了可靠的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。

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