兔骨性關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)軟骨的彌散張量研究

侯 進(jìn)，梅穎潔，代月黎，許乙凱

(南方醫(yī)院影像中心，南方醫(yī)科大學(xué)，廣州 510515)

骨關(guān)節(jié)疾病給人類造成的危害愈來愈受到國際醫(yī)學(xué)界的關(guān)注及擔(dān)憂，骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)發(fā)病率隨年齡增高而增加[1]，OA是一個以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)楹诵?，累及骨質(zhì)并包括滑膜，關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)其它結(jié)構(gòu)的全方位，多層次，不同程度的關(guān)節(jié)疾病[2]。隨著磁共振技術(shù)的發(fā)展，磁共振功能新的成像技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于骨性關(guān)節(jié)炎軟骨損傷早期評價的研究，磁共振擴散張量成像(diffusion tensor imaging，DTI)可定量分析水分子在不同方向上擴散的各向異性，從而觀察組織的細(xì)微結(jié)構(gòu),無創(chuàng)性地提供常規(guī)磁共振不能提供的人體組織微觀結(jié)構(gòu)。它不僅能獲取ADC值，而且更能獲取反映水分子擴散各向異性數(shù)值(fractional anisotropy，F(xiàn)A)，反應(yīng)透明軟骨膠原纖維微細(xì)結(jié)構(gòu)變化, 研究顯示ADC值和FA值對診斷早期軟骨損傷均有較高的特異性和敏感性[3]。但關(guān)節(jié)軟骨尤其是對OA關(guān)節(jié)軟骨的DTI研究不多，需要更多的實驗進(jìn)一步探討。

1 材料和方法

1.1 動物模型建立和處理

選用成年新西蘭大白兔24只，合格證號為[SCXK(粵)2011-0015]，將其隨機分成為A、B、C、D四組，其中A、B、C三組為處理組，采用膝關(guān)節(jié)備皮、予75%乙醇消毒后，屈曲45°以髕腱外緣、平髕骨下極處為進(jìn)針點，向髁間窩方向進(jìn)針，抵達(dá)股骨髁后回撤2 mm，注入0.3 mL體積分?jǐn)?shù)2%木瓜蛋白酶水溶液[4]。A組(一次注藥組)于模型制作完成后24 h內(nèi)行MR檢查；B、C組于實驗的1、4、7 d分三次注藥制作模型，B組于最后一次注藥完成后24 h內(nèi)行MRI檢查，C組于最后一次注藥后一個月行MRI檢查； D組作為空白組。A、B、C組檢查結(jié)束后將兔麻醉后處死，D組作為空白組分別在與A、B、C組掃描結(jié)束后隨機取出兩只麻醉后處死，將處死后兔的雙膝關(guān)節(jié)取下，10%甲醛浸泡，待病理檢查。

1.2 磁共振成像方法

A組在第一次注藥后24 h內(nèi)、B組在第三次注藥后24 h內(nèi)、C組在第三次注藥后一個月進(jìn)行掃描，A、B、C組掃描的同時對同期D組進(jìn)行磁共振成像。采用荷蘭Philips公司生產(chǎn)的Achieva 3.0T超導(dǎo)型MR掃描儀、專用動物線圈，行膝關(guān)節(jié)常規(guī)掃描，T1WI、T2WI和PDWI(加脂肪抑制)，再行DTI掃描分別測量關(guān)節(jié)軟骨FA和ADC值。掃描參數(shù)：DTI采用EPI序列，總掃描時間：07 min 55 s，F(xiàn)OV=120(RH)×120(AP)×24(FH)，TR=1000 ms，TE=56ms，層厚=2 mm，像素 1.2 mm×1.2 mm，NSA=4,翻轉(zhuǎn)角=90。PDW 采用TSE序列：FOV=80 mm×80 mm×36 mm，TR=2013 ms，TE=20 ms，層厚=2.5 mm，像素=0.40 mm×52 mm。

掃描完成后將動物處死取膝關(guān)節(jié)軟骨行HE染色與檢測蛋白多糖含量的阿爾新蘭染色(彩插5圖1)。

1.3 圖像后處理

采用ImageJ后處理軟件，在橫軸位質(zhì)子相圖像上，手動繪制感興趣區(qū)，盡可能包括整個髕軟骨面(彩插5圖2)，在對應(yīng)的DTI圖像上測定平均的ADC和FA值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 13．0軟件包，采方差分析對各組處理組、對照組之間在不同時間點軟骨的FA、ADC值變化進(jìn)行分析；P< 0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FA值各組間均有顯著差異；ADC值正常對照組與中期模型組無明顯差異，余各組間有顯著差異。

2.2 隨著退變程度的加重，F(xiàn)A值減低越明顯, 早期ADC值先增高后降低(彩插5圖3，表1)

表1 各模型組與正常組的ADC、FA值比較

3 討論

3.1 動物模型的選擇和建立

骨關(guān)節(jié)炎是因多種致病因素所導(dǎo)致的以關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)橹饕±硖卣鞯囊唤M臨床綜合癥，目前用于OA模型復(fù)制的動物有很多，但其病理變化機制及病變進(jìn)展速度有很大區(qū)別，如何選擇一個合適的動物模型，對研究來講是成功的關(guān)鍵[5-6]。鼠模型關(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類OA相似，基本能滿足要求，但對于這種較小動物的關(guān)節(jié)來講，關(guān)節(jié)腔反復(fù)注射的創(chuàng)傷對實驗影響較大；猴子具有與人類最相似的結(jié)構(gòu)，但獲之不易，價格高，研究跨度大；犬、羊等大型動物關(guān)節(jié)較大，較易操作造模，可供實驗用材料豐富，但操作也并不簡單，經(jīng)費不足也難以考慮。兔膝關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)與人類接近，可研究材料豐富，其模型的軟骨生化指標(biāo)與人類OA非常接近，兔性情溫和，手術(shù)操作較簡單，易于飼養(yǎng)和關(guān)節(jié)內(nèi)注射，關(guān)節(jié)體積較大，可供研究的材料又遠(yuǎn)多于其他動物，便于進(jìn)行比較研究。

3.2 兔膝關(guān)節(jié)OA模型的病理及MRI分級

根據(jù)膠原纖維的排列方式不同，關(guān)節(jié)軟骨在組織形態(tài)學(xué)上從表層至深層可分為四層[7]：①表層，構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的最外層，由平行于關(guān)節(jié)面致密排列的薄層膠原纖維組成，蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)在此層含量最低；②中間層，緊鄰表層，膠原纖維隨意向四周散開斜行排列，進(jìn)入軟骨表層；③深層：含有最豐富的PGs和膠原纖維，含水量很少，膠原纖維多呈垂直狀排列，與鈣化帶間有一被稱為“潮標(biāo)”的清楚分界；④鈣化層，含豐富的羥基磷灰石鹽，細(xì)胞極少。

兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)腔內(nèi)重復(fù)注射木瓜蛋白酶溶液可快速破壞、分解軟骨基質(zhì)，降解蛋白多糖。早期骨性關(guān)節(jié)炎模型組蛋白多糖減少，表層膠原纖維結(jié)構(gòu)改變，主要表現(xiàn)為Ⅱ型膠原含量基本不變，Ⅱ型膠原纖維的腫脹、膠原網(wǎng)的破壞；HE染色軟骨表面欠光整，可見簇集的軟骨細(xì)胞，Mankin評分2～5，MRI示關(guān)節(jié)軟骨邊緣毛糙。中期模型組軟骨表層及中間層膠原纖維中斷、纖維化，軟骨細(xì)胞及蛋白多糖進(jìn)一步減少；HE染色軟骨表層可見裂隙及纖維化改變，軟骨細(xì)胞排列紊亂，軟骨潮線不規(guī)則，Mankin評分8～9，MRI軟骨信號不均勻，邊緣模糊。晚期模型組軟骨破壞進(jìn)一步加重，軟骨缺損可達(dá)深層，累及潮線，可見大范圍的纖維化改變，軟骨細(xì)胞及蛋白多糖明顯減少，HE染色軟骨纖維化可達(dá)深層，軟骨細(xì)胞明顯減少，潮線基本消失，鈣化層難以分辨， Mankin評分9～11；磁共振示軟骨信號不均，軟骨面變薄、中斷，關(guān)節(jié)腔明顯積液。DTI FA偽彩圖可顯示纖維的位置與走行(彩插5圖3)。

對照組HE染色表層光滑、平整，軟骨細(xì)胞層次清楚，無簇集，潮線完整，Mankin評分0～1，膝關(guān)節(jié)矢狀位質(zhì)子相可見關(guān)節(jié)軟骨面光整、厚度均勻。

阿利新蘭檢測存在于軟骨細(xì)胞周圍的酸性粘多糖(硫酸軟骨素)，酸性粘多糖呈藍(lán)色。而骨性關(guān)節(jié)炎病變首先表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)的降解破壞與關(guān)節(jié)破壞區(qū)各種粘多糖減少, 特別是酸性粘多糖減少，藍(lán)色基質(zhì)淡染。處理組行股骨、脛骨及髕骨阿爾新蘭染色顯示軟骨周圍的酸性粘多糖較對照組變淺，表明軟骨基質(zhì)較對照組減少。

鑒于兔膝關(guān)節(jié)橫軸位DTI圖像上髕骨顯示清晰，另一方面，木瓜蛋白酶誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎模型三部位軟骨阿爾新蘭及HE染色結(jié)果一致，故設(shè)髕軟骨為測量的感興趣區(qū)域。

3.3 兔膝關(guān)節(jié)OA模型的DTI實驗結(jié)果分析

水分子的彌散運動表現(xiàn)分為各向同性彌散與各向異性彌散。高彌散區(qū)域具有高ADC值，低ADC值表示水分子彌散能力低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同分組之間ADC值有統(tǒng)計學(xué)差別，且ADC在早期升高較為明顯，隨著退變程度的加重，ADC值逐漸減低。我們推測此結(jié)果與軟骨的生化改變有關(guān)。關(guān)節(jié)退變中基質(zhì)組分的一種改變就是蛋白多糖的減少，其與ADC值的變化關(guān)系密切[8]，這與蛋白多糖對水分子的作用有關(guān)。正常軟骨中蛋白多糖通過自身的負(fù)電荷結(jié)合水分子，從而維持其生物力學(xué)特性。在軟骨病變早期，由于膠原纖維的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變和破壞，蛋白多糖減少及蛋白多糖的降解引起結(jié)合水的釋放，導(dǎo)致軟骨組織中結(jié)合水減少而關(guān)節(jié)間隙內(nèi)的自由水增加；此外，Ⅱ型膠原的退變增加了關(guān)節(jié)表面的摩擦和對水的通透性，關(guān)節(jié)液可滲入軟骨內(nèi)，因此，早期退變關(guān)節(jié)軟骨ADC值升高明顯。骨性關(guān)節(jié)炎中晚期軟骨變薄，出現(xiàn)纖維化，蛋白多糖大量流失，負(fù)電荷的減少直接導(dǎo)致軟骨水分的減少，所以在骨性關(guān)節(jié)炎中晚期軟骨ADC值逐漸減低。

FA值為定量分析各向異性最常用參數(shù)，反映水分子彌散的各向異性成分與各相同性成分的比值，自由水腦脊液的FA值為0。本兔子模型研究中，早期骨性關(guān)節(jié)炎退變主要是結(jié)構(gòu)的改變，Ⅱ型膠原含量基本不變，Ⅱ型膠原纖維的腫脹、膠原網(wǎng)的破壞，減弱了對蛋白多糖的限制，導(dǎo)致自由水的增加，F(xiàn)A值減低[9-10]；另外，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，膠原纖維走向方向異常，增粗的Ⅱ型膠原纖維中出現(xiàn)了Ⅰ型膠原纖維，這兩方面都將導(dǎo)致骨性關(guān)節(jié)炎中晚期FA值的降低。

FA值反映水分子彌散方向及反應(yīng)組織結(jié)構(gòu)的關(guān)系，提示FA值聯(lián)合ADC值診斷軟骨退變更為客觀而準(zhǔn)確[11]。

3.4 本實驗的不足和局限性

由于目前DTI的低空間分辨率，實驗所得到的圖像質(zhì)量不高，隨著技術(shù)和硬件的改進(jìn)，這方面的不足有望克服。本實驗的樣本數(shù)較少，因此本結(jié)果需要更大樣本量的研究進(jìn)一步驗證。

DTI能夠有效的反映軟骨組織成分改變，可以無創(chuàng)性量化評估軟骨早期損傷，在軟骨修復(fù)術(shù)后評估中也可能會具有重要臨床應(yīng)用價值。

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