低濃度84消毒液對小鼠生殖生理的影響

胡 玉，田 韻，周 麗，周 軍，丁志剛

(中南大學湘雅三醫(yī)院醫(yī)學實驗中心，長沙 410013)

84消毒液是含氯的次氯酸鈉溶液，具有廣譜、高效、快速的殺菌作用。目前動物實驗室多采用獨立通氣籠盒( individually ventilated cages, IVC)系統(tǒng)，而84消毒液是浸泡IVC籠具的常用消毒液之一。84消毒液用于IVC籠具的消毒效果已有報道[1]，但對于84消毒液對實驗動物生殖生理的影響未見報道,因此，本實驗使用84消毒液對KM小鼠生殖生理的影響進行研究。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠72只，雌雄各半，4周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2011-0003】。飼養(yǎng)在中南大學湘雅三醫(yī)院動物實驗中心【SYXK(湘)2010-0001】，整個實驗過程嚴格遵守醫(yī)院實驗動物中心標準操作規(guī)程，并且善待實驗動物。

1.2 實驗試劑與儀器

84消毒液(湖南湘雅集團有限公司，有效氯含量：4.0%～7.0%)；小鼠睪酮(T)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒、小鼠雌二醇(E2)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒，購自上海江萊生物科技有限公司；丙氨酸轉氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、血尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、膽固醇(CHO)試劑盒，購自廣州瑞宇生物科技有限公司；日立 LABOSPECT 003全自動生化分析儀，日本日立公司；電子天平(湖南湘儀，TP-620A)等。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組及處理 72只KM小鼠，經(jīng)1周適應性飼養(yǎng)后，隨機分為3組：2個劑量組(A組、B組) 和生理鹽水組(C組)，每組24只，雌雄各半。A組以0.5% 84消毒液(常用消毒濃度)灌胃0.5 mL，B組以2.0% 84消毒液灌胃0.5 mL，C組以生理鹽水灌胃0.5 mL，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃9周。

1.3.2 一般狀態(tài)觀察 實驗期間，每日觀察各組動物的攝食、飲水量、活動及毛色等狀況，每周稱量體重1次，連續(xù)稱量9周。

1.3.3 動情周期觀察：從第2周開始，連續(xù)8周，A、B和C組各隨機選取10只雌性小鼠，每天清晨采用陰道沖洗法做陰道脫落細胞涂片，光學顯微鏡下觀察脫落細胞形態(tài)，以了解動情周期變化情況。判斷標準參見教材[2]。

1.3.4 精子畸形率觀察：第9周結束時，A、B和C組各隨機選取6只雄性小鼠，取雙側附睪，置于生理鹽水中，分離包膜，剪碎附睪，過濾后將濾液以1000 r/min離心2 min，棄上清液后制成懸液涂片，甲醇固定15 min，0.5%伊紅染色1 min，置于玻片架上晾干，高倍鏡下觀察精子形態(tài)，每只動物觀察精子1000個，計算精子畸形率[3]。

1.3.5 性激素和生化指標測定：第9周結束時，A、B和C組各隨機選取12只，雌雄各半，眼球取血，分離血清，-20℃冰箱保存，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，分別測定雄性小鼠的睪酮水平和雌性小鼠雌二醇水平。剩余血清采用全自動生化分析儀對血清進行生化分析。

1.3.6 組織切片：眼球取血后即刻頸椎脫臼法處死動物，解剖切取心、肝、肺、腎、睪丸(或卵巢)，4%多聚甲醛固定。固定好的標本用梯度濃度的乙醇脫水，正丁醇透明，石蠟包埋，切片厚5 μm，HE染色。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般情況

經(jīng)觀察，各組小鼠外觀、活動、飲水和攝食量均未見異常，與生理鹽水組(C組)比較，0.5% 84消毒液組(A組)和2.0% 84消毒液組(B組)小鼠體重無顯著性差異(P> 0.05)(表1)。

2.2 動情周期

小鼠動情周期一般為4～5 d，與C組比較，A組和B組小鼠雌性小鼠動情周期均較為規(guī)律，無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

2.3 精子畸形率

觀察到的精子畸形率包括香蕉形、無鉤、胖頭、無定形、雙頭等。與C組比較，A組小鼠精子畸形率差異無顯著性(P> 0.05)，B組小鼠精子畸形率顯著增高(P=0.041<0.05)(表3)。

2.4 性激素測定

與C組比較，A組和B組小鼠雄性小鼠的睪酮水平和雌性小鼠的雌二醇水平差異無顯著性(P>0.05)(表4和表5)。

表1 雌性和雄性小鼠體重變化(g)

表2 雌性小鼠動情周期

表3 雄性小鼠精子畸形率

表4 雄性小鼠血清睪酮水平

2.5 生化指標

與C組比較，A組和B組小鼠丙氨酸轉氨酶、白蛋白、總蛋白、血尿素氮、肌酐、血糖、甘油三酯、膽固醇差異無顯著性(P>0.05)(表6)。

2.6 組織切片

A、B組與C組心、腦、肝、脾、肺、腎、睪丸(或卵巢)組織切片均未發(fā)現(xiàn)異常。彩插6圖1、2分別為三組卵巢、睪丸組織切片圖。

表5 雌性小鼠血清雌二醇水平

3 討論

IVC系統(tǒng)已被廣泛應用，而浸泡消毒是最常用的IVC籠具消毒方式，浸泡消毒后的籠盒自然會有消毒液殘留，實驗動物飼養(yǎng)在籠盒內，其殘留量是否對實驗動物產(chǎn)生影響早就引起實驗動物學界的關注[1,4]。同時，為了維護和保障實驗動物倫理福利，充分體現(xiàn)“不傷害原則”[5]，我們也應了解消毒液殘留量是否對實驗動物產(chǎn)生影響。

表6 血清生化指標

84消毒液具有廣譜、高效、快速的消毒殺菌作用，是浸泡IVC籠具的常用消毒液之一。李啟富等[1]研究表明，0.5% 84消毒液浸泡10 min，效果很好，一年多未見污染，裸小鼠質量檢測可達SPF級。本研究采用0.5%(常用消毒濃度)、2.0% 84消毒液分別對KM小鼠進行灌胃，對照組采用生理鹽水進行灌胃，對實驗小鼠的部分生殖生理相關指標進行了觀察：與生理鹽水組比較，0.5% 84消毒液組和2.0% 84消毒液組小鼠體重變化無顯著性差異，雌性小鼠的動情周期差異無顯著性，雄性小鼠血清睪酮和雌性小鼠雌二醇水平差異無顯著性，部分生化指標檢測無顯著性差異。三組小鼠的心、肝、肺、腎和睪丸(或卵巢)組織切片均未發(fā)現(xiàn)異常。與生理鹽水組比較，0.5% 84消毒液組小鼠精子畸形率差異無顯著性，但是2.0% 84消毒液組小鼠精子畸形率差異有顯著性(P=0.041<0.05)，提示此濃度的消毒液可能對小鼠的精子形成有影響，對于是否因此對小鼠繁殖性能有影響以及是否對仔鼠生長發(fā)育是否有影響還有待于進一步研究。

以上研究結果表明，0.5% 84消毒液對小鼠的生殖生理無明顯影響，2.0% 84消毒液組小鼠精子畸形率顯著增高，在實際使用中一定要嚴格控制消毒液濃度。下一步我們將對于低濃度消毒液對小鼠繁殖性能是否有影響以及是否對仔鼠生長發(fā)育有影響做進一步研究。

參考文獻：

[1] 李啟富，田澤敏，龔廷，等. IVC籠盒消毒滅菌效果的觀察[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2006，16(12)：757-759.

[2] 吳端生，張健. 現(xiàn)代實驗動物學技術[M]. 北京：化學工業(yè)出版社，2007年：46.

[3] 湯百爭，周正適，周智君. 低濃度臭氧對小鼠生殖生理的影響[J]. 中國比較醫(yī)學雜志，2005，15(1)：32-34.

[4] 顧鋒，王國強，沈志明，等. 獨立通氣籠合過氧乙酸滅菌效果初探[J]. 上海實驗動物科學, 2003 , 23(2)：111- 113.

[5] 賀爭鳴，李根平，李冠民，等.實驗動物福利與動物實驗科學[M]. 北京：科學出版社，2011年：47-49.