線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型手術操作的研究進展

石將通，趙 忠，蒙息標，田順亮

(1.廣西桂林醫(yī)學院臨床醫(yī)學院，桂林 541001；2.廣西桂林醫(yī)學院人體解剖學教研室，桂林 541004)

缺血性腦血管疾病是威脅人類健康與生存的主要疾病之一，是中老年人常見病，具有高發(fā)病率、高患病率、高死亡率、高致殘率、高復發(fā)率的特點，給患者及其家庭和社會造成巨大的負擔。腦缺血動物模型是開展腦缺血損傷和治療研究的基礎，大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型被公認為標準的局灶性腦梗死動物模型[1]。其中線栓法MCAO是研究缺血性腦損傷動物模型的首選造模方法[2]。自Koizumi等[3]于1986年首先采用線栓法成功制備大鼠MCAO模型以來，隨后不斷有研究者對其改良，但因制模方法的缺陷和不足，目前操作仍較復雜，腦梗死區(qū)域不穩(wěn)定，重復性較差[4]，尚未形成統(tǒng)一的制模標準。本文擬從線栓法MCAO模型手術操作部位的選擇以及近年來所做改良進行探討。

1 血管的解剖位置

大鼠局灶性腦缺血模型的建立涉及到大鼠的頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈、枕動脈和翼腭動脈等頸部主要血管，因此明確血管的解剖位置是建模手術的關鍵。相關文獻中存在著兩種頸部動脈血管分布圖，差異主要集中在大鼠頸外動脈和頸內動脈的分布情況上[5]。有的文獻所繪圖中，頸內動脈位于頸外動脈的內側[6-7]，而在有的圖中，頸內動脈與頸外動脈的位置恰好相反[8]。馮珂[5]在造模過程中發(fā)現(xiàn)，頸總動脈在分叉處分為兩條直徑相當、單純從形態(tài)方面難以區(qū)分的動脈。從正面觀察，兩動脈在頸總動脈分叉處基本呈背腹分布，而非內外分布。經進一步解剖、分離，方可確定在腹側的動脈是頸外動脈，在背側的是頸內動脈。汪飛[9]也提到，在沿頸總動脈向上分離到頸總動脈分叉處時，朝腹側走行的是頸外動脈，朝背內側走行的是頸內動脈。張成英[10]通過灌注后進行顯微觀測，頸外動脈管徑為0.80±0.09 mm，頸內動脈近段管徑為0.71±0.10 mm，頸外動脈與頸內動脈之間的角度為28.25°±1.37°。頸外動脈第一分支為枕動脈, 行向前外, 斜跨頸內動脈近段的腹側，其管徑0.25±0.04 mm；頸內動脈在鼓泡后緣發(fā)出的第一分支為翼腭動脈, 其繞至鼓泡外緣穿鼓泡至其前緣經巖鼓裂淺出,主要分布至眼、鼻、口處,翼腭動脈管徑為0.52±0.05 mm , 其起始處距頸內動脈起始處距離為3.61±0.41 mm , 與頸內動脈之間的角度為66.9°±1.65°[10]。頸內動脈和頸外動脈，及其分支翼腭動脈和枕動脈的位置、走行等解剖學資料仍存在不確定性或欠缺，這會導致MCAO造模時間延長，出血增多，對大鼠的傷害增大，甚至建模失敗。因而，有必要對大鼠頸部主要動脈血管的位置、走行進行進一步的研究。

2 大鼠頸部手術切口位置的選擇

頸部手術切口主要有頸部正中切口和頸部旁側切口兩種。1986年Koizumi等[3]首次提出線栓法制造腦缺血模型時采用的即是頸部正中切口, 后續(xù)文獻[11-15]報道的多數(shù)學者亦采用此法, 頸部正中切口逐步成為經典的手術入路。頸部正中切口比較直觀，但是正中切口需要經過頜下腺、頸部淋巴結，分離胸骨舌骨肌、肩胛舌骨肌、胸乳突肌、鎖骨乳突肌、二腹肌等肌肉，分離和保護氣管、迷走神經、交感神經和舌咽神經叢等，該方法具有一定的手術風險和難度，對操作人員有較高的要求[16]。而頸部旁側入路的優(yōu)勢在于[17-19]:手術視野暴露較充分；易于分離肌肉和血管, 特別是深在的翼腭動脈；出血少；對氣管刺激性小, 不需要輔助呼吸, 從而降低了手術難度和動物死亡率。馮珂等[5]在實驗中分別采用兩種位置切口造模，比較之后亦認為:頸部旁側切口更適合建模的要求。但頸部旁側切口的具體位置目前尚無統(tǒng)一標準，有的在頸正中線偏右約0.2～0.3 cm處[19-20]；有的在頸正中線偏右約0.5 cm[21]。汪飛[9]認為在采用頸部旁側手術入路時，切口在中間稍偏外側0.5 cm～1.0 cm 即可，此時切口線正好在頸闊肌和胸鎖乳突肌夾隙處，如太靠外側會給分離肌肉帶來難度。

3 左右側別的選擇

大鼠MCAO模型側別的選擇目前尚未形成統(tǒng)一的共識，左右側別都有人選擇[22-26]。但在文獻報道中,以右側手術居多。由于大鼠左、右側大腦半球的解剖和生理功能不對稱，大鼠左、右側MCAO后會造成皮質和藍斑內的去甲腎上腺素和黑質內的多巴胺水平變化不一樣，導致左、右半球腦缺血后行為和生化改變不一致，若選擇左側動脈，危險系數(shù)比較大[27]。由于大鼠左側迷走神經直接分布于心臟，在對大鼠進行頸部手術操作時會對頸部迷走神經造成損傷，對心臟功能產生較大影響，容易造成血壓的波動。而選擇右側可以減少腦外影響因素，有助于保持呼吸、體溫及血壓等全身狀況的平穩(wěn)[17]。手術操作時, 要根據研究的目的確定栓塞的側別, 而不能隨意選擇一側；若出于盡量減少腦外影響因素的考慮, 建議做急性大鼠腦缺血實驗時，盡量選擇右側大腦中動脈栓塞[28]。但有實驗發(fā)現(xiàn)左、右側手術入路模型并無明顯區(qū)別，對模型制備的成功率也沒有太大影響[5,29]。

4 線栓插入位置的選擇

MCAO模型制作的關鍵是插入栓線的頭端能否到達大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)起始處，正確選擇插線位置以便線栓能準確到達MCA起始部的同時盡可能減少對血管的損傷是十分重要的。線栓的插入主要有兩種方法：一種是采用頸外動脈切口，將線栓由頸外動脈插入，插入后向下輕按頸外動脈使之與頸內動脈成近似直線，順頸外動脈走向經頸總動脈分叉處進入頸內動脈進而前行阻斷MCA；另一種是從頸總動脈插線，經頸內動脈到達MCA起始部。

從頸外動脈插線有兩個好處[30]：一方面是線栓如果誤入頸內動脈的分支翼腭動脈，可通過調整頸外動脈殘端而更利于線栓深入到頸內動脈直至大腦前動脈；另一方面大腦供血的主要動脈為頸總動脈，如果從頸總動脈剪口，復灌時無法松開頸總動脈，即無法實現(xiàn)充分再灌注。頸外插入線栓可保留頸總動脈的完整性，再灌注時將線栓抽出后只需扎緊頸外動脈殘端，即可打開頸總動脈而實現(xiàn)充分復灌，這也更符合臨床病理特征。但經頸外動脈插線也有不足之處：剪斷頸外動脈對實驗動物的損傷太大，若不剪斷而只游離頸外動脈，則由于該動脈與頸內動脈之間的角度太小(28.25°±1.37°)，線栓不易進入頸內動脈，而且頸外動脈比較細，眼科剪很難把握，易把動脈剪斷且不能有效控制出血量，再灌注取出栓線時由于心臟壓力較大，較容易造成腦內出血導致動物死亡；而且經頸外動脈插線，到達大腦中動脈的距離較長，相應地插入線栓的時間較長[10]；此法操作難度較大，需要有一定經驗[31]。

頸總動脈插線法的特點是操作簡單，比較容易掌握，插入線栓比較順利，成功率較高[9]。采用從頸總動脈插入線栓，不分離和夾閉頸內動脈，也不結扎翼腭動脈，對血管的機械刺激僅限于頸總動脈，對生理結構的損傷小。結果顯示有恒定的梗死灶形成，重復性好，難度小，手術易施行[32]。從解剖學角度來說，頸內動脈相當于頸總動脈的直接延續(xù)，所以線栓走行路徑順暢，插線多能順利進行。實驗中將頸總動脈永久結扎，這就更保證了大鼠的腦缺血；而雙側頸外動脈之間的廣泛吻合，能保證再灌注的進行[33]。但有人認為該方法將導致持久的同側頸總動脈阻塞，限制再灌注血流[5]；頸總動脈末端附近有頸動脈竇和頸動脈小球，操作不慎，容易引起實驗動物血壓升高和呼吸異常[34]。

除了從頸總動脈插線和頸外動脈插線兩種方法之外，張成英等[10]采用20只經墨汁乳膠混合液灌注的大鼠腦標本，對頸內、外動脈的形態(tài)分布，頸內動脈與頸外動脈之間以及頸內動脈與其第一分支之間的角度進行顯微觀察和測量，認為翼腭動脈起始處是線栓法經頸內動脈制作大鼠大腦中動脈區(qū)腦缺血模型的最佳插線部位，它定位準確、簡便易行、創(chuàng)傷小，能夠極大提高模型制作的成功率。

近年來，研究者不斷地就線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的改良方案進行探索，盡管制模的成功率有所提升，但仍難以形成統(tǒng)一的制模標準。目前研究多著力于制模方法及其手術操作的探索，而對大鼠頸部與制模相關的血管及其周圍伴行神經的基礎研究尚有不足，手術中對血管、神經的損傷是制模失敗的一個重要原因。因此，有必要對大鼠頸部相關血管及其周圍神經進行進一步的研究觀測，以減少對大鼠的損傷，提高線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的成功率。

參考文獻：

[1] Durukan A，Tatlisumak T．Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models，pathophysiology，and therapy of focal cerebral ischemia[J]．Pharmacol Biochem Behav，2007，87( 1) : 179-197．

[2] 王橋生，符暉，曾紅科．線栓法大鼠局灶腦缺血模型的改進與評價[J]．中南醫(yī)學科學雜志，2012，40(5)：291-294．

[3] Koizmi J，Yoshid Y，Nakazawa T，etal．Experimental studies of ischemic brain edema：a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area[J]．Stroke，1986，16(8)：1-8．

[4] 李晶，郭利平．線栓法制備大鼠局灶性腦缺血模型的研究進展[J]．天津中醫(yī)藥大學學報，2008，72(1)：54-56．

[5] 馮珂，紀立金．線栓法制備大鼠大腦中動脈阻塞模型的體會[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2013，40(1)：21-23.

[6] Longa EZ，Weinstein PR，CarlsonS，etal．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]．Stroke，1989，20：84-91．

[7] 顧振，韓群穎，蘇殿三，等．大鼠短暫性局灶性腦缺血模型改進的制作方法[J]．南京醫(yī)科大學學報，2001，21(6)：513-514．

[8] 蔣海山，陸兵勛，姬仲，等．線栓法大鼠缺血/再灌注腦損傷模型的改良[J]．第一軍醫(yī)大學學報，2004，24(10)：1156-1159．

[9] 汪飛，儲照虎，趙守才．線栓法大鼠大腦中動脈閉塞模型的制備[J]．基層醫(yī)學論壇，2011，15(1)，14-17．

[10] 張成英，趙旭東．栓線法制作大鼠局灶性腦缺血模型插線部位的選擇[J]．四川解剖學雜志，2004，12(2)：110.

[11] 張小沖，趙浩，馬建華，等．線栓法大鼠MCAO 模型的實驗研究[J]．醫(yī)學研究雜志，2013，42(6)：55-58．

[12] 王曉麗，王玲．局灶性腦缺血對大鼠胃黏膜屏障功能的影響[J]．哈爾濱醫(yī)科大學學報，2013，47(6)：205-208.

[13] 許賢平，易飛，楊曉蘇，等．大鼠局灶性腦缺血后LMO4和pCREB的表達[J]．中風與神經疾病雜志，2013，30(6)：497-499．

[14] 王榮亮，劉小蒙，張營，等．大鼠局灶性腦缺血后神經功能評分與腦梗死體積相關性分析[J]．首都醫(yī)科大學學報，2013，34(2)：69-74．

[15] Jingyu Zhang，Zhigang Yu，Zhiqiang Yu，etal．rAAV-mediated delivery of brain-derived neurotrophic factor promotes neurite outgrowth and protects neurodegeneration in focal ischemic model [J]．Int J Clin Exp Pathol，2011，4(5)：496-504．

[16] 張瑩，舒兆瑞，沈梅紅．線栓法制備腦缺血再灌注的影響因素及探討[J]．遼寧中醫(yī)藥大學學報，2012,12(12)：80-83．

[17] 陳春富，李勁松．栓線法大鼠局灶性腦缺血模型的研究[J]．中風與神經疾病雜志，1996，13(1)：18-19．

[18] 劉運泉，戴穎．線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的改進[J]．中國臨床解剖學雜志，2005，23(2)：222-223．

[19] 王張，張藝，趙啟鵬，等．大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型的動態(tài)變化[J]．中藥藥理與臨床，2012，28(3)：116-119．

[20] 吳培要，王靜，謝麗芬，等．線栓大鼠大腦中動脈缺血模型制作方法的改進[J]．貴陽醫(yī)學院學報，2009，1(2)：108-110．

[21] 馬賢德，孫宏偉，柴紀嚴，等．線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型的方法研究[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2009，6(6)：1200-1201．

[22] 崔景軍，何嬌君，李晶，等．大鼠大腦中動脈梗死模型的評價標準探討[J]．天津中醫(yī)藥，2013，30(1)：33-35．

[23] 王柳清，邵蓓，林真珍，等．大鼠大腦中動脈近端及遠端阻塞腦缺血模型的腦梗死體積和行為學差異比較[J]．中國臨床神經學，2013，21(3)：259-263．

[24] 王振華，劉云會，馬騰，等．大鼠局灶性腦缺血再灌注早期血腦屏障通透性變化的研究[J]．中國醫(yī)科大學學報，2012，41(12)：1073-1076．

[25] Robinson RG．Differential behavioral and biochemical effects of Right and left hemispheric cerebral infarction in rat [J]．Science，1979，205(4407)：707-710．

[26] Eun-Ah Bae，Yang-Jin Hyun，Min-kyung Choo，etal．Protetive Effect of Fermented Red Ginseng on a Transient Focal Ischemic Rats [J]．Arch Pharm Res，2004，27(5)：1136-1140．

[27] Ganta Vijay Chaitanya，Hanithi Prakash Babu. Activation of Calpain，Cathepsin-b and Caspase-3 during Transient Focal Cerebral Ischemia in Rat Model[J]． Neurochem Res，2008，33(3)：2178-2186．

[28] 高煥民．大鼠腦的優(yōu)勢半球與腦缺血模型例別的選擇[J]．醫(yī)學綜述，2002，8(1)：95．

[29] 吳曉毅，陳華德．線栓法大鼠局灶性腦缺血模型的研究[J]．神經病學與神經康復學雜志，2006，3(1)：40-43．

[30] 陳嵐，曹良勛，錢貽菘，等．缺血再灌注時間對小鼠大腦中動脈閉塞模型的影響[J]．中國新藥雜志，2012，21(11)：1292-1295．

[31] 趙帥，樊小農，孟智宏，等．線栓法制備大鼠中動脈缺血閉塞模型研究進展[J]．江西中醫(yī)藥，2012，43(3)：77-80．

[32] 吳松笛，耿曉英，夏峰，等．改良線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的實驗研究[J]．陜西醫(yī)學雜志，2006，10(35)：1316．

[33] 楊德兵，馬存根，尉杰忠．腦缺血-再灌注動物模型的改良與評價[J]．中國醫(yī)藥指南，2011，9(5)：6-7．

[34] 王棕可，胡躍強．大鼠腦缺血再灌注模型改良的探討[J]．中國中醫(yī)急癥，2011，20(8)：1286-1287．