STAT5a在乳腺癌組織中的低表達(dá)與患者不良預(yù)后相關(guān)*

劉 威， 龍梅珺， 吳玨堃， 李 璽， 邱萬壽△

(1廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院乳腺科，廣東 廣州 510220； 2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院甲乳外科，廣東 廣州 510630)

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白5a(signal transducer and activator of transcription 5a, STAT5a)是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白家族的重要成員，能夠影響細(xì)胞的增殖、分化、存活與凋亡，并且在乳腺發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[1-2]。本研究采用免疫組化方法檢測(cè)STAT5a在乳腺癌組織中的表達(dá)情況，分析STAT5a蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，探索STAT5a在乳腺癌患者中潛在的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 研究對(duì)象及分組

收集2007年01月至2009年01月期間在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行乳腺手術(shù)病人的乳腺組織標(biāo)本110例，其中病理組織學(xué)證實(shí)為浸潤(rùn)性乳腺癌的組織標(biāo)本100例，另外10例為正常乳腺組織標(biāo)本，作為對(duì)照組。所有患者均為女性。入組乳腺癌組的病人需要滿足如下條件：(1) 所有乳腺癌患者在術(shù)前均經(jīng)過系統(tǒng)檢查獲得較為準(zhǔn)確的臨床分期，并且排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；(2)所有患者均為原發(fā)性乳腺癌，術(shù)前未經(jīng)任何化療、放療和其它抗腫瘤治療；(3) 患者行乳腺癌改良根治術(shù)或根治術(shù)，術(shù)后依照患者的臨床病理學(xué)情況進(jìn)行規(guī)范的術(shù)后輔助治療，且有完整的臨床病案資料，均隨訪5年以上。

2 免疫組化試劑及方法

2.1試劑 鼠抗人STAT5a多克隆抗體，購(gòu)自Abcam，稀釋100倍。DAB顯色試劑(二氨基聯(lián)苯胺)購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司。

2.2免疫組化SP法染色步驟 將入組的乳腺組織標(biāo)本切片做STAT5a的免疫組化檢測(cè)，具體方法如下：(1) 烤片；(2) 脫蠟和水化；(3) 微波抗原修復(fù)：將切片放入EDTA 抗原修復(fù)液(1∶50稀釋)容器中，置微波爐用中高火加熱至沸騰，沸騰后繼續(xù)加熱10 min，然后斷電，自然冷卻至室溫；(4) 甩去PBS緩沖液，放在3% H2O2中室溫孵育15 min； (5) 滴加山羊血清封閉液，室溫下孵育30 min； (6) 甩去PBS緩沖液，每張載玻片加適量的Ⅰ抗STAT5a抗體，空白對(duì)照組用PBS緩沖液代替Ⅰ抗，置于4℃冰箱濕盒內(nèi)過夜；(7) 次日于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫30 min，每張載玻片加適量的Ⅱ抗，37 ℃恒溫箱中恒溫孵育30 min； (8) 每張載玻片滴加適量新鮮配制的DAB顯色劑(1∶50配制)，顯微鏡下控制反應(yīng)時(shí)間(顯色時(shí)間約為2 min)，陽性顯色為棕黃色或者黃褐色，自來水沖洗5 min，終止反應(yīng)；(9) 甩去自來水，蘇木素復(fù)染5 min，自來水沖洗5 min，終止反應(yīng)；(10) 切片用鹽酸乙醇分化5 s，然后用自來水充分沖洗20 min；(11) 脫水透明：梯度乙醇脫水；(12) 封片；(13) 鏡下觀察、拍照、評(píng)分。

2.3染色對(duì)照 用 PBS緩沖液(pH 7.4)替代Ⅰ抗作為陰性對(duì)照。用已知陽性切片做陽性對(duì)照。

2.4結(jié)果判斷 STAT5a以細(xì)胞核和細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性反應(yīng)，陰性表達(dá)細(xì)胞呈淡藍(lán)色。參照Fromowitz的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，在400倍高倍鏡視野下每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)視野，采用陽性細(xì)胞占觀察細(xì)胞百分比結(jié)合陽性細(xì)胞染色程度進(jìn)行判斷，陽性細(xì)胞數(shù)所占比例: 無陽性細(xì)胞計(jì)為0分，<25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%計(jì)為4分；染色程度: 無色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，棕黃色計(jì)為2分，棕褐色為3分。兩者得分總和即為最后評(píng)分，最后評(píng)分0～1分為陰性，2～7分為陽性。

3 病例資料收集及隨訪

所有乳腺癌病例進(jìn)行電話隨訪、查閱病例資料等方式獲取生存時(shí)間資料(隨訪自手術(shù)日起，以死亡為觀察終點(diǎn))。通過查閱患者的病案資料，獲取患者的發(fā)病年齡、月經(jīng)狀況、臨床分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分級(jí)、病理類型、分子分型、免疫組化指標(biāo)(ER、PR、HER-2)等臨床病理資料。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1 STAT5a在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達(dá)情況

STAT5a以目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或者黃褐色的顆粒為陽性反應(yīng)，見圖1，陰性表達(dá)細(xì)胞呈淡藍(lán)色。100例浸潤(rùn)性乳腺癌標(biāo)本中，STAT5a的陽性表達(dá)率為46%；在10例正常乳腺組織中均未見STAT5a陽性表達(dá)，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=7.906，P<0.05)。

Figure 1. The positive expression of STAT5a in the breast cancer. A: ×200; B:×400.

2 STAT5a在乳腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理因素之間的關(guān)系

乳腺癌組織中STAT5a的表達(dá)與患者的年齡、月經(jīng)狀態(tài)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù)、臨床分期、腫瘤大小及分子標(biāo)記物(HER-2)的表達(dá)情況無關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤分級(jí)及激素受體(ER、PR)表達(dá)情況之間呈顯著相關(guān)(P<0.05)。在100例浸潤(rùn)性乳腺癌中，6例I級(jí)分化乳腺癌，56例Ⅱ級(jí)分化乳腺癌，38例Ⅲ級(jí)分化乳腺癌，其STAT5a陽性表達(dá)率分別為66.67%、60.71%和21.05%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。STAT5a陽性表達(dá)率在ER+與ER-、PR+與PR-的乳腺癌之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 STAT5a在乳腺癌組織中的表達(dá)情況與臨床病理因素之間的關(guān)系

3 STAT5a在乳腺癌組織中的表達(dá)情況與分子亞型之間的關(guān)系

在100例浸潤(rùn)性乳腺癌中，luminal A 型乳腺癌中STAT5a陽性表達(dá)率為54.55%，luminal B 型乳腺癌中STAT5a陽性表達(dá)率為47.22%，HER2 過表達(dá)型乳腺癌中STAT5a陽性表達(dá)率為33.33%，三陰型乳腺癌中STAT5a陽性表達(dá)率為38.46%，各組的STAT5a陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

4 乳腺癌病人生存分析

生存分析發(fā)現(xiàn)STAT5a陽性組乳腺癌患者5年生存率高于STAT5a陰性組，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，STAT5a陽性組患者具有一定的生存優(yōu)勢(shì)，見圖2。單因素分析發(fā)現(xiàn)臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及STAT5a表達(dá)情況與患者5年生存率之間存在關(guān)聯(lián)，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。利用 Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，STAT5a、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期是影響乳腺癌患者生存的預(yù)后因素，見表2。

Figure 2. Kaplan-Meier plots of cumulative survival for STAT5a positive patients and STAT5a negative patients.

表2 100 例乳腺癌患者Cox回歸模型多因素分析

討 論

乳腺癌是世界范圍內(nèi)女性發(fā)病率最高的一種惡性腫瘤，約占女性全身惡性腫瘤的7%～10%。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究中心統(tǒng)計(jì)，2008年全球約有138萬新發(fā)女性乳腺癌病例，占全部女性惡性腫瘤新發(fā)病例的22.9%，全年因乳腺癌死亡的女性達(dá)46萬，占所有女性惡性腫瘤死亡病例數(shù)的13.7%[3]。目前，全世界乳腺癌發(fā)病率正以每年3%的速度增長(zhǎng)，乳腺癌患者群亦呈現(xiàn)出年輕化的趨勢(shì)[4]。因此，乳腺癌嚴(yán)重危害著廣大婦女的身心健康，對(duì)乳腺癌診治的研究具有非常重要的意義。

在乳腺癌研究領(lǐng)域中，STAT5a是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白家族的重要成員。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白廣泛存在于細(xì)胞漿中，目前發(fā)現(xiàn)STATs 家族共有7 個(gè)成員：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5a、STAT5b和STAT6。具有高度保守分子結(jié)構(gòu)的STATs家族成員可在多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮作用，對(duì)人體免疫、細(xì)胞增殖、分化、存活等產(chǎn)生重要影響[5]。在STATs家族中，STAT5a由于能夠影響細(xì)胞的增殖、分化、存活與凋亡，并且在乳腺發(fā)育及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展等中具有重要作用而被廣泛關(guān)注。

STAT5a蛋白在乳腺發(fā)育及其正常生理功能方面具有十分重要的作用。在分化發(fā)育過程中，STAT5a具有不可或缺的作用，STAT5a基因完全缺失，乳蛋白基因的表達(dá)會(huì)受到影響，乳腺也將無法分化[6]。在乳腺發(fā)育的不同階段，乳腺上皮細(xì)胞中都能檢測(cè)到一定量STAT5a蛋白的表達(dá)。但STAT5a蛋白并不是以一種相對(duì)穩(wěn)定的模式表達(dá)，STAT5a的酪氨酸磷酸化狀態(tài)與乳蛋白基因的活化及乳腺的發(fā)育狀態(tài)存在密切的關(guān)系。在妊娠后期和泌乳早期，STAT5a的磷酸化水平增加，而在哺乳后期則會(huì)下降。在乳腺退化的階段，STAT5a作為一個(gè)具有抗凋亡作用的存活因子而存在，其抗凋亡作用可能是通過調(diào)控下游靶基因Bcl-xL實(shí)現(xiàn)的[7-8]。

目前大量研究已證實(shí)STAT5a在乳腺上皮細(xì)胞中不適當(dāng)活化可誘發(fā)乳腺癌的事實(shí)[9-11]。小鼠乳腺癌研究的數(shù)據(jù)表明，在乳腺癌早期，STAT5a可促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化并加快腫瘤的生長(zhǎng),這對(duì)腫瘤的發(fā)生是非常重要的[12]。然而，STAT5a在惡性乳腺上皮細(xì)胞中是具有雙重功效的,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在乳腺癌晚期，STAT5a是調(diào)控并促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞分化的關(guān)鍵分子，它能夠有效地延緩腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)程[13]。

在正常乳腺組織中, STAT5a 蛋白多以無活性的狀態(tài)存在于胞質(zhì)中, 而在乳腺癌細(xì)胞中STAT5a則被持續(xù)活化并易位入核內(nèi)。陳晶等[14]研究發(fā)現(xiàn)低分化乳腺癌組織中STAT5蛋白表達(dá)水平高于高分化乳腺癌, 提示STAT5可能與乳腺癌的分化有關(guān)，且STAT5高表達(dá)于腫瘤較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、較晚的臨床分期和激素受體陰性的乳腺癌，但缺乏與患者生存預(yù)后關(guān)系的研究。張秀忠等[15]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT5在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)在乳腺癌發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用，但其與預(yù)后無明顯關(guān)系。Cotarla等[16]的一項(xiàng)包括 78例乳腺癌標(biāo)本的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中STAT5a的陽性表達(dá)率高達(dá)76%，其陽性表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)高分化、核內(nèi)p27表達(dá)水平的增加和不良預(yù)后有關(guān)。Yamashita等[17]檢測(cè)了517例乳腺癌組織，STAT5a的陽性表達(dá)率為34%，高表達(dá)于低分化、激素受體陽性乳腺癌，高表達(dá)者內(nèi)分泌治療敏感，且與患者良好預(yù)后相關(guān)。一項(xiàng)由Peck等[18]主持的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中STAT5a的陽性表達(dá)率為42%，高表達(dá)于激素受體陽性乳腺癌，高表達(dá)者內(nèi)分泌治療敏感，STAT5a的陽性表達(dá)與患者良好預(yù)后相關(guān)。綜合起來，相當(dāng)比例的乳腺癌表達(dá)STAT5a，而各個(gè)研究關(guān)于STAT5a陽性表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理因素之間關(guān)系的結(jié)果不一致。最近Peck等[19]進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中STAT5a蛋白表達(dá)水平在乳腺癌進(jìn)展中逐漸下降，而且乳腺癌中STAT5a低表達(dá)(核內(nèi)蛋白水平、組織mRNA水平)與患者不良預(yù)后相關(guān)，而STAT5b則不存在這種情況。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中STAT5a蛋白的低表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了Peck的報(bào)道。我們推測(cè)之前的研究結(jié)果的不一致，其可能的重要原因是有些研究沒有區(qū)分STAT5a與STAT5b。

本研究就STAT5a蛋白的表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征、預(yù)后之間的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：浸潤(rùn)性乳腺癌組織中STAT5a的陽性表達(dá)率為46%，乳腺癌組織中STAT5a的陽性表達(dá)率顯著高于正常乳腺組織，提示STAT5a可能參與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展。分析乳腺癌組織中STAT5a的表達(dá)情況與患者臨床病理因素之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中STAT5a的表達(dá)與患者的腫瘤分級(jí)及激素受體(ER、PR)表達(dá)情況存在關(guān)聯(lián)。高分化、激素受體陽性乳腺癌組織高表達(dá)STAT5a。生存分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT5a陽性組乳腺癌患者的5年生存率高于STAT5a陰性組，STAT5a陽性組乳腺癌患者具有一定的生存優(yōu)勢(shì)；STAT5a、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期是影響乳腺癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。這些結(jié)果提示STAT5a陽性表達(dá)是乳腺癌患預(yù)后良好的指標(biāo)，STAT5a可以作為乳腺癌臨床預(yù)后判斷的生物學(xué)標(biāo)記物。

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