自噬對(duì)HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響*

汪軍兵， 林麗清， 江明亮， 陸大祥， 陳桂玲， 行妍妍， 董 軍 △

(1廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院，廣東 廣州 511400； 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 2病理生理學(xué)教研室， 3國(guó)家中醫(yī)藥管理局病理生理學(xué)三級(jí)科研實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510632 )

自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)某些胞質(zhì)成分通過(guò)一系列嚴(yán)格調(diào)控的途徑，最后被溶酶體內(nèi)蛋白酶降解，釋放出大分子物質(zhì)再循環(huán)的過(guò)程。巨自噬[1](macroautophagy)是指胞質(zhì)成分被囊泡樣雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體包裹后，再與溶酶體融合成自噬溶酶體進(jìn)行降解，此種類型在自噬的3種方式中最為多見，本文提及的自噬均指巨自噬。有關(guān)自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路較為復(fù)雜，其中研究得最多的是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)依賴性信號(hào)通路。

HIV-1 gp120是人類免疫缺陷病毒1(human immunodeficiency virus 1, HIV-1)表達(dá)于病毒表面的包膜糖蛋白，HIV-1 gp120V3環(huán)是其5個(gè)可變區(qū)之一，是HIV-1病毒輔助受體的特異性和細(xì)胞嗜性的主要決定因子，參與組成輔助受體結(jié)合位點(diǎn)，而且V3環(huán)還參與gp120與輔助受體結(jié)合過(guò)程并在其中起主要作用[2]。艾滋病感染者中40%～60%會(huì)發(fā)展為HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知障礙(HIV-associated neurocognitive disorder, HAND)，其機(jī)制至今尚未完全闡明。HIV-1 gp120是神經(jīng)元損傷的一個(gè)重要因素，以HIV-1 gp120作用于神經(jīng)元是研究HAND損傷機(jī)制的一個(gè)常用細(xì)胞模型。

在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中至少存在6類電壓門控鈣離子通道，L型Ca2+通道是其中之一，它是導(dǎo)致細(xì)胞鈣離子內(nèi)流的主要因素[3]。本室前期研究已經(jīng)證實(shí)[4]，HIV-1 gp120V3環(huán)可引起原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元凋亡，且參與L型Ca2+通道電流的改變；然而，關(guān)于mTOR依賴性自噬信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以HIV-1 gp120作用于原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元，同時(shí)加入mTOR依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制劑及激動(dòng)劑，以全細(xì)胞膜片鉗記錄L型Ca2+通道電流，旨在研究自噬中mTOR依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響，從而為臨床上HAND的防治提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

gp120V3環(huán)購(gòu)自Raybiotech；3-MA購(gòu)自Sigma；rapamycin購(gòu)自StressMarq；Neurobasal 培養(yǎng)基及B27購(gòu)自Gibco；多聚賴氨酸購(gòu)自Sigma。電極外液組成： NaCl 120，CsCl 5，TEA-Cl 10，BaCl210，HEPES 10，MgCl21，TTX 0.0005。電極內(nèi)液組成：CsCl 120，MgCl22，Na2ATP 5，HEPES 10，glucose 11，EGTA 11。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

取新生24 h內(nèi)SD乳鼠，用裝有75%乙醇的噴壺噴滿乳鼠全身，無(wú)菌環(huán)境下開顱分離雙側(cè)海馬，置預(yù)冷PBS 液中洗滌3遍去除血液，然后轉(zhuǎn)入20 mL小玻璃瓶中，眼科剪剪碎，再轉(zhuǎn)入無(wú)菌100 mL輸液瓶中，加入相當(dāng)于海馬組織總體20倍左右的DMEM/F12液與0.25%胰蛋白酶混合液(1∶1)，置37 ℃培養(yǎng)箱消化15 min，中間吹打2次，每次20 s，再加入胎牛血清1 mL終止消化，分別用200目和400目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾去除組織塊，吸取濾過(guò)液， 4 ℃、1 000 r/min離心5 min，棄上清，加完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，收集懸液，取5 μL懸液以1∶1體積加入臺(tái)盼藍(lán)染色，觀察細(xì)胞存活狀態(tài)，調(diào)整細(xì)胞濃度5×108/L，種植于經(jīng)10 % 多聚賴氨酸包被的petri皿內(nèi)，4 h全量換液，更換為含2% B27的Neurobasal培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(Neurobasal培養(yǎng)基-2%B27條件培養(yǎng)基可抑制膠質(zhì)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，促進(jìn)海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)成熟)，之后每3 d半量換液1次，取培養(yǎng)7 d 的海馬神經(jīng)元用于實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)分為2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，即空白對(duì)照組、gp 120V3組、自噬阻斷劑3-MA組和gp120V3+3-MA組；空白對(duì)照組、gp120V3組、自噬激動(dòng)劑rapamycin組和gp120V3+rapamycin組。

3 全細(xì)胞記錄

玻璃毛坯經(jīng)P97微電極拉制儀經(jīng)三步法拉制成尖端直徑為2～3 μm的電極，沖灌電極內(nèi)液。去培養(yǎng)液，以電極外液輕洗去雜質(zhì)，換上電極外液，將皿置于倒置顯微鏡載物臺(tái)上，20倍物鏡找到胞體光亮飽滿的神經(jīng)元，沖灌玻璃微電極并將其安裝在放大器探頭的電極夾持器上，在電壓鉗模式下用微操縱器引導(dǎo)玻璃微電極靠近細(xì)胞，在電極入液后始終給予5 ～6 cm H2O的正壓，以防尖端堵塞。將微電極尖端調(diào)整至胞體正上方，然后在持續(xù)正壓的同時(shí)讓電極尖端緩慢靠近細(xì)胞，利用特定的測(cè)試方波判斷細(xì)胞的封接狀態(tài)。待電極尖端接觸細(xì)胞表面時(shí)，顯示的方波會(huì)因封接阻抗增大而產(chǎn)生相應(yīng)變化，輕輕給予電極內(nèi)負(fù)壓，形成高阻封接(1 GΩ)，此時(shí)形成貼附式膜片(cell-attached patch)，正確補(bǔ)償電容后穩(wěn)定1 min，再給予負(fù)壓吸破電極尖端的細(xì)胞膜，此處細(xì)胞內(nèi)、外液相通，補(bǔ)償電容電流和串聯(lián)電阻，形成全細(xì)胞膜片鉗(whole-cell patch)，穩(wěn)定3～5 min進(jìn)行記錄。實(shí)驗(yàn)中的串聯(lián)阻抗在進(jìn)行補(bǔ)償時(shí)可由放大器面板直按讀出，并被補(bǔ)償65%～75%。電流信號(hào)經(jīng)Ag/AgCl電極引導(dǎo)，數(shù)據(jù)經(jīng)Digtal 1320A轉(zhuǎn)換器記錄，采樣頻率為5 kHz，濾波頻率為1 kHz。記錄時(shí)，將高阻封接的細(xì)胞電位鉗制在-50 mV持續(xù)300 ms，階躍10 mV的10個(gè)去極化電壓鉗制記錄L-型Ca2+通道電流-電壓曲線。實(shí)驗(yàn)中鉗制電壓和電路電阻隨時(shí)被檢測(cè)，只有基線、鉗制電壓和電路電阻穩(wěn)定的數(shù)據(jù)才被納入分析數(shù)據(jù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)應(yīng)用Clamfit 10.2軟件和SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，所得電流利用膜電容標(biāo)化后以電流密度(pA/pF)表示，繪制I-V曲線。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)單因素方差分析(One-way ANOVA)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 自噬抑制劑3-MA對(duì)gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元L-型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng)7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型Ca2+通道電流在空白對(duì)照組、gp120V3(1 mg/L)組、3-MA(5 mmol/L)組和gp120V3+3-MA組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)平均值分別為-9.63±1.43、-16.06±1.57、-19.15±2.21和-22.55±2.08；gp120V3組及3-MA組與空白對(duì)照組比較，有顯著差異(P<0.05),說(shuō)明加入gp120V3環(huán)或加入3-MA均可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強(qiáng)；gp120V3+3-MA組與gp120V3組比較，有顯著差異(P<0.05)，提示加入3-MA抑制自噬后可使受gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強(qiáng)，見圖1。

2 自噬激動(dòng)劑rapamycin對(duì)gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的影響

由電壓步階產(chǎn)生的內(nèi)向L型鈣離子通道電流在原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 7 d后被記錄，從-50 mV～+40 mV的電壓步階產(chǎn)生的L型鈣離子通道電流在空白對(duì)照組、gp120V3(1 mg/L組)、rapamycin(2 μmol/L)組和gp120V3+rapamycin組經(jīng)膜電容標(biāo)化后峰值電流密度(pA/pF)為9.63±1.43 、-16.06±1.57、-5.68±0.48和-7.46±0.83，gp120V3組及rapamycin組與空白對(duì)照組比較，有顯著差異(P<0.05),說(shuō)明加入gp120V3環(huán)可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流增強(qiáng)，加入rapamycin可使海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流減弱；gp120V3+rapamycin組與gp120V3組比較，差異顯著(P<0.05)，提示加入自噬激動(dòng)劑rapamycin后可使受gp120V3環(huán)作用的海馬神經(jīng)元的L型鈣離子通道電流減弱，見圖2。

Figure 2. The effect of autophagic excitor rapamycin on the peak current amplitude of hippocampal neurons treated with gp120V3 loop. A： voltage steps of L-type calcium channel; B： the average peak current amplitude in different groups; C： I-V curves of peak current density in different groups; D： bar chat of peak current density in different groups. Mean±SD. n=8.*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs gp120V3 group.

討 論

自噬具有雙重功能，當(dāng)自噬在對(duì)不同形式的細(xì)胞應(yīng)激作出反應(yīng)時(shí)可被快速上調(diào)，這種快速的自噬誘導(dǎo)可以通過(guò)清除細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器、毒性代謝分子及細(xì)胞內(nèi)的病原體，并通過(guò)產(chǎn)生維持細(xì)胞重要功能所必需的細(xì)胞內(nèi)構(gòu)件，以利于細(xì)胞的生存，但自噬的持續(xù)性激活也可導(dǎo)致細(xì)胞最終發(fā)生自噬性細(xì)胞死亡[5]。

在自噬的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，mTOR信號(hào)通路是研究得最多的一條，它包括AMPK/mTOR和ERK/ mTOR和PI3K-Ⅰ/ mTOR，但這3類均要通過(guò)信號(hào)分子mTOR。AMPK可抑制mTOR，對(duì)自噬起增強(qiáng)作用，ERK和Ⅰ型PI3K激動(dòng)mTOR，對(duì)自噬起抑制作用[6]。Rapamycin是自噬激動(dòng)劑，它可與靶點(diǎn)mTOR結(jié)合抑制其活性，從而增強(qiáng)自噬。3-MA是Ⅲ型PI3K的抑制劑。Ⅲ 型PI3K位于mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游，它與beclin 1形成復(fù)合物參與自噬體的形成，對(duì)自噬起到促進(jìn)作用，故3-MA可抑制自噬，是科研實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的一種自噬阻斷劑[7]。

HIV-1 gp120是HIV-1的一種包膜糖蛋白，可致神經(jīng)元凋亡[8]，但對(duì)神經(jīng)元自噬的影響報(bào)道較少。Zhou等[9]以gp120作用于神經(jīng)母細(xì)胞瘤SK-N-SH細(xì)胞6 h，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬增強(qiáng)。

HIV-1 gp120既可引起海馬神經(jīng)元自噬增強(qiáng)，亦可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡，這其中自噬與凋亡的關(guān)系還未研究清楚。Qin等[10]將自噬和凋亡的標(biāo)記物共同標(biāo)記在同一神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞上，發(fā)現(xiàn)自噬與凋亡同時(shí)存在，但損傷后不同時(shí)間內(nèi)自噬與凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)不同，傷后短時(shí)間以自噬為主，隨時(shí)間延長(zhǎng)則以凋亡為主。

在本實(shí)驗(yàn)中，加入gp120V3環(huán)后乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞膜上的L型Ca2+通道電流增強(qiáng)。結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，3-MA使L型Ca2+通道電流增強(qiáng)，而rapamycin使L型Ca2+通道電流減弱，說(shuō)明在正常生理情況下，通過(guò)對(duì)mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行抑制或激動(dòng)可使海馬神經(jīng)元L型Ca2+通道電流發(fā)生改變。同時(shí)結(jié)果還顯示 gp120V3+3-MA組較gp120V3組L型Ca2+通道電流增強(qiáng)，gp120V3+rapamycin組較gp120V3組L型Ca2+通道電流減弱，說(shuō)明海馬神經(jīng)元在HIV-1 gp120V3環(huán)作用的環(huán)境下，通過(guò)對(duì)mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行抑制或激動(dòng)亦使L型Ca2+通道電流發(fā)生改變。

本實(shí)驗(yàn)從電生理角度證明，自噬可能參與了HIV-1 gp120V3環(huán)介導(dǎo)的海馬神經(jīng)元L型鈣離子通道電流的改變。為臨床上對(duì)自噬進(jìn)行干預(yù)，即通過(guò)改變自噬狀態(tài)來(lái)保護(hù)海馬神經(jīng)元，從而防治HAND提供理論依據(jù)。

[參 考 文 獻(xiàn)]

[1] Crotzer VL, Blum JS. Autophagy and intracellular surveillance: Modulating MHC class II antigen presentation with stress[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2005, 102(22):7779-7780.

[2] Cormier EG, Dragic T. The crown and stem of the V3 loop play distinct roles in human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein interactions with the CCR5 coreceptor[J]. J Virol, 2002, 76(17):8953-8957.

[3] Kapur A, Yeckel MF, Gray R, et al. L-Type calcium channels are required for one form of hippocampal mossy fiber LTP[J]. J Neurophysiol, 1998, 79(4):2181-2190.

[4] Tang HM, Pan R, Fang WL, et al. Curcumin ameliorates hippocampal neuron damage induced by human immunodeficiency virus-1[J]. Neural Regen Res, 2013, 8(15):1368-1375.

[5] Shi R, Weng J, Zhao L, et al. Excessive autophagy contributes to neuron death in cerebral ischemia[J]. CNS Neurosci Ther, 2012，18(3):250-260.

[6] Meijer AJ, Codogno P. Regulation and role of autophagy in mammalian cells[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2004, 36(12):2445-2462.

[7] Petiot A, Ogier-Denis E, Blommaart EF, et al. Distinct classes of phosphatidylinositol 3-kinases are involved in signaling pathways that control macroautophagy in HT-29 cells[J]. J Biol Chem, 2000, 275(2):992-998.

[8] Gong Z, Yang LJ, Tang HM, et al. Protective effects of curcumin against gp120 V3 loop-induced neuronal injury in rats[J]. Neural Regeneration Res, 2012, 7(3):171-175.

[9] Zhou T, Xu L, Dey B, et al. Structural definition of a conserved neutralization epitope on HIV-1 gp120[J]. Nature, 2007, 445(7129)：732-737.

[10]Qin AP, Zhang HL, Qin ZH. Mechanisms of lysosomal proteases participating in cerebral ischemia-induced neuronal death[J]. Neurosci Bull, 2008, 24(2): 117-123.