人源間變性大細(xì)胞淋巴瘤BALB/c小鼠建模的免疫學(xué)機(jī)制

牟東云, 陸 靜, 張 燕 ,白雪芹, 鄧 飛

(遵義醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室， 貴州 遵義 563099)

目前腫瘤研究中常用的小鼠模型有自發(fā)和誘發(fā)腫瘤模型，移植性腫瘤模型和基因工程小鼠模型，其中移植性腫瘤模型應(yīng)用最廣，多采用同種腫瘤移植或免疫缺陷鼠的異種腫瘤移植，而人源腫瘤非免疫缺陷動(dòng)物模型國內(nèi)外均未見報(bào)道[1-2]。淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，與機(jī)體免疫微環(huán)境之間的關(guān)系異常密切，建立具有免疫功能的淋巴瘤動(dòng)物模型十分必要。本課題組前期試驗(yàn)中[3]，選擇人源間變性大細(xì)胞淋巴瘤(anaplastic large cell lymphoma ,ALCL)細(xì)胞株Karpas-299為腫瘤來源，選擇在免疫學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的具有正常免疫功能的近交系BALB/c小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過環(huán)磷酰胺(Cytoxan，CTX)預(yù)處理，成功建立人源ALCL BALB/c小鼠模型。此次試驗(yàn)，我們?cè)诮⑷嗽碅LCL BALB/c小鼠腫瘤模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)其成瘤的免疫機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和動(dòng)物 人ALCL細(xì)胞株Karpas-299(4-5代)購自ACC-DSME公司。BALB/c小鼠40只，雌性，4～6周齡，體質(zhì)量18g左右，購自北京華阜康生物科技有限公司，在恒溫、恒濕、無特定病原體(SPF)環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 環(huán)磷酰胺購自修正藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司；抗人CD20、CD30、ALK、CD45RO單克隆抗體購自北京中杉公司；抗鼠CD3、CD4、CD8、CD19、CD20熒光抗體及相應(yīng)同型對(duì)照購自eBiosciense公司；流式細(xì)胞儀及其配套的計(jì)算機(jī)軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)為BD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) Karpas-299細(xì)胞用含10%的胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中。

1.3.2 腫瘤模型建立 BALB/c小鼠40只，隨機(jī)分為CTX對(duì)照組10只，腫瘤組30只，以250 mg/kg劑量的CTX腹腔注射預(yù)處理，3 d后，腫瘤組小鼠右腋下皮下注射Karpas-299細(xì)胞0.5 mL(1×107/mL)，隔3d注射一次，共3次；CTX對(duì)照組同期注射等量生理鹽水。每天定時(shí)觀察，腫瘤組視成瘤情況分為成瘤組和未成瘤組，第24天(以注射CTX的時(shí)間計(jì)算)采血后脫頸處死成瘤組小鼠，取腫瘤行病理檢查；未成瘤組采血后繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.3.3 腫瘤模型的鑒定 結(jié)合腫瘤組織HE染色形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及免疫組化(immunohistochemical，IHC)表達(dá)情況綜合診斷ALCL。免疫組化染色陽性判定：CD20胞膜或胞漿著色、CD30胞漿和胞膜著色、ALK胞漿和或胞核著色、CD45RO胞膜著色。

1.3.4 免疫指標(biāo)檢測方法 采用小鼠眼內(nèi)眥靜脈取血法或摘眼球取血法收集各BALB/c小鼠外周血，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)(直接免疫熒光染色法)檢測其T、B淋巴細(xì)胞亞群的比例。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c小鼠成瘤情況 CTX對(duì)照組注射CTX后精神萎靡，毛發(fā)蓬松，飲食量下降，兩周后活動(dòng)及飲食恢復(fù)至注射CTX前。腫瘤組BALB/c小鼠注射腫瘤后5d開始捫及包塊，隨著腫瘤增大，出現(xiàn)右上肢活動(dòng)受限，腫瘤中心開始潰爛壞死。未成瘤小鼠注射部位見脫毛潰爛后逐漸痊愈，或見腫脹的包塊又逐漸消失，至第24天，24只BALB/c小鼠成瘤(即成瘤組)，6只未成瘤(即未成瘤組)，成瘤率80%。成瘤組腫瘤組織鏡下表現(xiàn)為細(xì)胞大或中等大小、胞漿豐富、核仁淺染、核分裂像常見，免疫組化瘤細(xì)胞表達(dá)ALK、CD30，不表達(dá)CD20及CD45RO，符合ALCL的組織學(xué)和免疫表型診斷標(biāo)準(zhǔn)(見圖1)。未成瘤組小鼠均無瘤存活3個(gè)月后處死。

A：腫瘤大體解剖；B：HE×200倍;C：IHC ×400倍CD30+；D：IHC ×400倍ALK+。圖1 BALB/c小鼠腫瘤組織

2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群比例 第24天，收集各組小鼠外周血行流式細(xì)胞術(shù)檢測其T、B淋巴細(xì)胞亞群比例。結(jié)果顯示：成瘤組與CTX對(duì)照組相比，CD3+、CD8+、CD19+細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)；未成瘤組與CTX對(duì)照組相比，CD8+、CD19+細(xì)胞比例降低，CD20+細(xì)胞比例升高(P<0.05)；未成瘤組與成瘤組相比，CD3+、CD4+、CD8+、CD20+細(xì)胞比例更高(P<0.05)。由此可見，成瘤組CD3+、CD8+細(xì)胞比例下降與CTX對(duì)照組和未成瘤組相比均有意義(P<0.05)，未成瘤組CD20+細(xì)胞比例升高與CTX對(duì)照組和成瘤組相比均有意義(P<0.05)(見表1)。

組別CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD19(%)CD20(%)CTX組25.94±1.0716.36±3.733.97±0.899.21±0.211.83±0.21成瘤組3.83±2.12*2.03±0.920.41±0.23*1.24±1.21*5.27±1.71未成瘤組37.10±21.31&29.42±19.45&1.95±0.48*&0.49±0.18*33.12±15.07*&F16.71110.72853.6250.88019.351P0.0010.0070.0000.0000.001

*P<0.05，與CTX組比較 ；&P<0.05，與成瘤組比較。

2.3 連續(xù)監(jiān)測CTX對(duì)BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群的影響 為了探討CTX所致免疫變化對(duì)腫瘤的生長有何影響，本實(shí)驗(yàn)連續(xù)檢測了注射CTX后BALB/c小鼠的免疫變化。CTX對(duì)照組第3天，BALB/c小鼠CD3+細(xì)胞比例高于注射CTX前(P<0.05)，CD19+細(xì)胞比例低于注射CTX前(P<0.05)；第10天，所測所有免疫參數(shù)值均低于注射CTX前，其中CD8+、CD19+、CD20+細(xì)胞比例下降有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；第17天和第24天，CD8+、CD19+和CD20+細(xì)胞比例仍低于注射CTX前(P<0.05)，但較第10天有逐漸回升趨勢(P>0.05)(見表2、圖2)。

時(shí)間(d)CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD19(%)CD20(%)CTX之前32.59±12.3612.72±6.6010.84±2.6826.17±5.305.92±2.40CTX 366.47±14.75*31.46±15.899.74±0.792.16±1.27*9.85±2.28CTX 1014.19±1.633.74±0.281.26±0.78*5.51±0.70*2.92±0.03*CTX 1720.94±0.3717.76±0.596.14±0.28*9.03±0.13*2.66±0.85*CTX 2425.94±1.0716.36±3.733.97±0.89*9.21±0.21*1.83±0.21*F10.3742.98316.23429.2028.680P0.0050.0990.0010.0000.008

*P<0.05，與注射CTX之前比較。

圖2 注射CTX后BALB/c小鼠外周血T、B淋巴細(xì)胞亞群的變化趨勢

3 討論

淋巴瘤是起源于淋巴造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，與人體免疫系統(tǒng)之間的關(guān)系異常密切，建立具有免疫功能的淋巴瘤動(dòng)物模型將更真實(shí)的模擬淋巴瘤發(fā)生發(fā)展的自然過程。實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明BALB/c小鼠的異種移植由于機(jī)體強(qiáng)烈的免疫排斥不會(huì)成瘤[4]，CTX是造血干細(xì)胞移植預(yù)處理的經(jīng)典用藥，是造血干細(xì)胞移植預(yù)處理的經(jīng)典用藥，具有明顯的免疫抑制作用[5]，因此，本實(shí)驗(yàn)在建模前對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行了CTX預(yù)處理。通過對(duì)CTX對(duì)照組外周

血T、B淋巴細(xì)胞亞群檢測發(fā)現(xiàn)，腫瘤接種后的第一周，機(jī)體經(jīng)歷了嚴(yán)重的免疫抑制過程，這一周正好是成瘤的關(guān)鍵時(shí)期，其成瘤機(jī)制與CTX所致機(jī)體免疫抑制不無關(guān)系。有報(bào)道稱大劑量CTX可誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體免疫耐受性，使其對(duì)多種特異性抗原在一段時(shí)間內(nèi)無應(yīng)答反應(yīng)[6]。CTX對(duì)照組第17天和第24天的數(shù)據(jù)顯示CTX所致的機(jī)體免疫抑制開始恢復(fù)，但成瘤組腫瘤依然生長迅速，說明恢復(fù)的免疫對(duì)腫瘤的生長已不能發(fā)揮關(guān)鍵作用，腫瘤誘導(dǎo)BALB/c小鼠免疫耐受或已形成。

T細(xì)胞免疫被認(rèn)為在抗腫瘤免疫中居中心地位[7]。一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[8]表明惡性淋巴瘤患者CD3+、CD4+T 細(xì)胞比值較對(duì)照組下降，CD8+T 細(xì)胞較對(duì)照組升高。而本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，成瘤組除CD20+B細(xì)胞輕度升高外，其余免疫指標(biāo)全部下降，尤其是CD3+、CD8+細(xì)胞比例下降明顯，這可能和ALCL進(jìn)展快，所測時(shí)間點(diǎn)不同，腫瘤類型不同等有關(guān)。Nelson BH[9]的實(shí)驗(yàn)認(rèn)為反應(yīng)性的B細(xì)胞(CD20+B細(xì)胞)可能是腫瘤浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞產(chǎn)生長久，強(qiáng)效抗腫瘤免疫反應(yīng)的重要條件。本實(shí)驗(yàn)未成瘤組CD20+細(xì)胞比例升高，CD20+B細(xì)胞在抗腫瘤免疫方面或許發(fā)揮著重要作用。

本次試驗(yàn)僅檢測了ALCL模型成瘤過程中特異性免疫細(xì)胞的總體變化，認(rèn)為ALCL成瘤過程與機(jī)體免疫抑制有關(guān)，并可能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生腫瘤免疫耐受，ALCL迅速增殖可能與CD3+、CD8+細(xì)胞明顯減少有關(guān)。改善ALCL免疫抑制微環(huán)境，打破ALCL免疫耐受，提升CD8+細(xì)胞數(shù)或可成為ALCL免疫治療研究的方向。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 王碩,蘇杭,袁經(jīng)權(quán),等. 實(shí)驗(yàn)小鼠在癌癥研究中的應(yīng)用及其進(jìn)展[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2011,21(9):63-67.

[2] Ruggeri B A, Camp F,Miknyoczki S. Animal models of disease: pre-clinical animal models of cancer and their applications and utility in drug discovery[J]. Biochem Pharmacol， 2014,87(1):150-161.

[3] 白雪芹. 間變性大細(xì)胞淋巴瘤BALB/c小鼠腫瘤模型的建立和鑒定[D]. 遵義：遵義醫(yī)學(xué)院, 2013.

[4] 張志培,趙佐慶,張盈華,等. 免疫缺陷小鼠腫瘤模型的建立及其腫瘤相關(guān)免疫機(jī)制的探討[J]. 世界華人消化雜志,2002,10(4):376-380.

[5] 王聰,王一騰,魏鑫. 環(huán)磷酰胺的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2008，7(8):179.

[6] 王瑜,田晶,李科,等. 免疫抑制小鼠腎包膜下胃癌移植瘤模型的建立及微血管觀察[J]. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,25(6):571-573.

[7] 孫君重, 肖文華, 于力, 等. CD4+T淋巴細(xì)胞功能研究新進(jìn)展[J]. 中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志, 2010, 18(2): 544-548.

[8] 鄒煦, 常炳慶, 黃新春, 等. 惡性淋巴瘤患者外周血 T 淋巴細(xì)胞亞群變化的討論[J]. 癌癥進(jìn)展, 2012, 10(4): 396-398.

[9] Nelson B H. CD20+B cells: the other tumor-infiltrating lymphocytes[J]. J Immunol，2010,185(9):4977-4982.