密花核果木抗腫瘤有效部位的篩選研究

惠++陽(yáng)②++陳光英++宋小平++陳文豪

熱帶藥用植物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南?？?571127）

摘 要 采用3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT）法，以2種人腫瘤細(xì)胞株（SGC-7901、SPCA-1）為研究對(duì)象，對(duì)海南地區(qū)核果木屬植物密花核果木的抗腫瘤有效部位進(jìn)行篩選研究。采用硅膠柱色譜分離技術(shù)對(duì)石油醚、氯仿萃取部位進(jìn)行進(jìn)一步的分離，獲得不同極性組分。抗腫瘤活性試驗(yàn)結(jié)果表明，石油醚、氯仿萃取部位及其不同極性組分顯示不同程度的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性，是其抗腫瘤有效部位。

關(guān)鍵詞 核果木屬 ；密花核果木 ；抗腫瘤活性 ；SGC-7901 ；SPCA-1

分類號(hào) R284.1

全世界大戟科（Euphorbiaceae）核果木屬（Drypetes）植物約200種，主要分布在亞洲、美洲和非洲中西部等熱帶、亞熱帶地區(qū)。在非洲民間，該屬植物為傳統(tǒng)藥材，主要用于治療淋病、惡性腫瘤、黑熱病、類風(fēng)濕、支氣管炎等癥[1-2]，藥用史由來(lái)已久。中國(guó)核果木屬植物產(chǎn)13種，2變種，分布于臺(tái)灣、廣東、海南、廣西、貴州和云南等省區(qū)[3]。近10年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該屬植物進(jìn)行了廣泛的化學(xué)成分研究，從中分離得到倍半萜內(nèi)酯[4-6]、羅漢松烷型二萜[7-8]、齊墩果烷和木栓烷型三萜[9-11]、查爾酮[12]和一些多酚類化合物[13]，同時(shí)還進(jìn)行了諸如抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲(chóng)、抗真菌和α-葡萄糖苷酶抑制活性等藥理活性研究[4-6，9-11，13]，但針對(duì)該屬植物進(jìn)行抗腫瘤活性方面的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

密花核果木（Drypetes congestiflora Chun & T. Chen）分布于海南、廣東、云南等省的山地疏林中，是一新擬種，為海南主要經(jīng)濟(jì)林木[3]，以Drypetes congestiflora為關(guān)鍵詞，在SciFinder數(shù)據(jù)庫(kù)搜索發(fā)現(xiàn)，目前未見(jiàn)國(guó)內(nèi)外對(duì)其化學(xué)成分和藥理活性的相關(guān)研究報(bào)道。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其乙醇提取物對(duì)人肺癌細(xì)胞（SPCA-1）、人胃癌細(xì)胞（SGC-7901）及人白血病細(xì)胞（K-562）具有較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞毒活性。筆者對(duì)密花核果木的乙醇提取物的不同溶劑萃取物進(jìn)行進(jìn)一步抗腫瘤活性篩選，以期為跟蹤分離具有較好抗腫瘤活性的單體化合物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

密花核果木的莖于2011年7月采自海南省昌江市。經(jīng)海南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院鐘瓊芯教授鑒定為大戟科（Euphorbiaceae）核果木屬（Drypetes）密花核果木（Drypetes congestilora Chun & T. Chen）。

1.1.2 儀器與試劑

高壓滅菌鍋（森展企業(yè)有限公司）；倒置顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）；Elx800型酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；MCO-15AC型CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYO公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）。RPMI-1640培養(yǎng)液（Gibco公司）；胰酶（Gibco公司）；MTT（Sigma公司）；優(yōu)級(jí)新生牛血清（蘭州民海生物工程有限公司）；硅膠柱層析填料（青島海洋化工廠分廠，200-300目）。石油醚（60～90℃）、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇（西隴化工股份有限公司）。

1.1.3 細(xì)胞株

人肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1（南方醫(yī)科大學(xué)）；人胃癌細(xì)胞株SGC-7901（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院）。

1.2 方法

1.2.1 樣品的制備

采密花核果木莖20 kg用95%乙醇室溫浸泡3次，5 d/次，合并提取液，減壓濃縮得粘稠狀棕色浸膏1.0 kg，將其加水懸浮分散，分別用石油醚（60～90℃），氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得相應(yīng)萃取部位：石油醚（80 g），氯仿（120 g），乙酸乙酯（15 g）和正丁醇（450 g）。

稱取石油醚部位75 g，采用80 g（200～300目，下同）柱層析硅膠拌樣，800 g硅膠濕法裝柱，采用石油醚～乙酸乙酯（30∶1～3∶2）梯度洗脫，TLC檢測(cè)合并相同流份，減壓濃縮得A1 （石油醚∶乙酸乙酯=30∶1），A2（20∶1），A3（15∶1），A4（10：1），A5（8∶1），A6（5∶1），A7（3∶1）， A8（2∶1），A9（3∶2）；氯仿萃取部位（115 g）加硅膠（110 g）拌樣，揮干。硅膠1.0 kg濕法裝柱，氯仿～乙酸乙酯（25∶1～0∶1）梯度洗脫。TLC檢測(cè)合并相同流份，減壓濃縮得B1 （氯仿∶乙酸乙酯=25∶1），B2 （15∶1），B3 （9∶1），B4（6∶1），B5（4∶1），B6 （3∶1），B7（2∶1），B8（0∶1）。以上4種不同溶劑萃取部位和石油醚、氯仿萃取部位各個(gè)極性組分均用于抗腫瘤活性篩選。

1.2.2 體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性實(shí)驗(yàn)

腫瘤細(xì)胞株培養(yǎng)：用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)（MTT法[14]）：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞株，用0.25%的胰蛋白酶消化，10% 新生小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)制成5×104個(gè)/mL 的細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種180 μL。在37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)8～10 h，待其貼壁，每個(gè)孔加入用PBS配制的樣品液，使得樣品終濃度分別為1、10和100 μg/mL。每個(gè)濃度平行3孔，繼續(xù)培養(yǎng)44 h后，每孔加入50 μL MTT （1 mg/mL，PBS配制），在37℃、5% CO2條件下繼續(xù)溫育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入150 μL DMSO，在微型振蕩器上搖勻15 min，結(jié)晶溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上選擇570 nm，測(cè)定各孔的吸光值，同時(shí)設(shè)置空白組（僅加入含細(xì)胞的培養(yǎng)液）和對(duì)照組（以培養(yǎng)液替代藥物），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組3孔OD值平均值/對(duì)照組3孔OD值平均值）×100%。endprint

IC50值的測(cè)定：根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時(shí)抑制率>50%的樣品，進(jìn)一步測(cè)定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)。若樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率>50%再進(jìn)行IC50值測(cè)定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對(duì)所選腫瘤細(xì)胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)SPCA-1、SGC-7901腫瘤細(xì)胞增殖抑制率試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個(gè)組分均具有相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無(wú)明顯斑點(diǎn)，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點(diǎn)；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點(diǎn)，綜合文獻(xiàn)所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對(duì)于后期活性成分分離需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲(chóng)、抗真菌等活性研究，尚未開(kāi)展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)林木，資源豐富，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] Dalziel M J. The useful plants of west tropical africal[M]. London： The Crown Agents for the Colonies 1937， 140-141.

[2] Irvine F R. Woody plants of Ghana [M]. London： Oxford University Press， 1961， 223-226.

[3] 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì)，中國(guó)植物志[M]，北京：科學(xué)出版社，1994， 44：39-51.

[4] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic properties of the stem extract of Drypetes molunduana Pax and Hoffm. （Euphorbiaceae）in rats[J]. Pharmaceutical and Pharmacological Letters， 2001， 11（2）： 61-63.

[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

[6] Wansi J D， Wandji J， Lallemand M C， et al. Antileishmanial furansesquiterpene and triterpenoids from Drypetes chevalieri Beille （Euphorbiaceae）[J]. Bol Latinoam Caribe Plant Med Aromat， 2007， 6（1）： 5-10.

[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

（下轉(zhuǎn)第68頁(yè)）endprint

IC50值的測(cè)定：根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時(shí)抑制率>50%的樣品，進(jìn)一步測(cè)定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)。若樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率>50%再進(jìn)行IC50值測(cè)定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對(duì)所選腫瘤細(xì)胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)SPCA-1、SGC-7901腫瘤細(xì)胞增殖抑制率試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個(gè)組分均具有相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無(wú)明顯斑點(diǎn)，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點(diǎn)；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點(diǎn)，綜合文獻(xiàn)所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對(duì)于后期活性成分分離需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲(chóng)、抗真菌等活性研究，尚未開(kāi)展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)林木，資源豐富，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

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[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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IC50值的測(cè)定：根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)初步篩選結(jié)果，選擇濃度為100 μg/mL時(shí)抑制率>50%的樣品，進(jìn)一步測(cè)定其半數(shù)抑制濃度IC50。以同一樣品濃度對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率作縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算出樣品IC50值。采用SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑萃取部位對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取部位進(jìn)行抗腫瘤試驗(yàn)。若樣品濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制率>50%再進(jìn)行IC50值測(cè)定。結(jié)果如表1所示，石油醚部位對(duì)所選腫瘤細(xì)胞株SPCA-1、SGC-7901均顯示不同程度的增殖抑制活性，IC50值分別為100.20，70.27 μg/mL；氯仿萃取部位對(duì)SGC-7901細(xì)胞顯示微弱抑制增殖活性，IC50值為130.41 μg/mL。

2.2 石油醚、氯仿部位不同極性組分對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

采用MTT法對(duì)密花核果木莖乙醇提取物的石油醚部位（A1～A9）、氯仿部位（B1～B8）不同極性組在濃度為100 μg/mL時(shí)，對(duì)SPCA-1、SGC-7901腫瘤細(xì)胞增殖抑制率試驗(yàn)。結(jié)果如表2所示，石油醚萃取部位的不同極性組分表現(xiàn)出較為廣泛的增殖抑制活性，抑制率從30.67%～85.61%，且A6-A9這5個(gè)組分均具有相當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞毒活性。進(jìn)一步TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在254 nm紫外燈照射下均無(wú)明顯斑點(diǎn)，而采用硫酸乙醇（5% V/V）顯色劑顯色發(fā)現(xiàn)，它們主要為三萜或者是甾醇類的特征紫色或紫紅色斑點(diǎn)；而氯仿萃取部位的不同極性組分也表現(xiàn)出較萃取部位更好的抗腫瘤活性，其中B1、B5-B7的活性較好，抑制率從56.78%～74.69%。TLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其與石油醚部位的成分存在明顯差異，特別是254 nm紫外燈照射下顯示有明顯斑點(diǎn)，綜合文獻(xiàn)所述，核果木屬植物化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可能存在羅漢松烷型二萜或倍半萜內(nèi)酯等具有共軛體系的化合物，這對(duì)于后期活性成分分離需要重點(diǎn)關(guān)注。

3 討論

核果木屬植物作為非洲民間治療惡性腫瘤的傳統(tǒng)藥材，但目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)該屬植物主要側(cè)重于抗炎鎮(zhèn)痛、抗病原蟲(chóng)、抗真菌等活性研究，尚未開(kāi)展抗腫瘤活性方面的研究工作。密花核果木作為海南地區(qū)主要經(jīng)濟(jì)林木，資源豐富，但目前尚未見(jiàn)有關(guān)其化學(xué)成分及藥理活性的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，密花核果木莖乙醇提取物的石油醚、氯仿萃取部位的不同極性組分顯示出廣泛的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。為密花核果木植物資源的綜合利用及抗腫瘤藥開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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[5] Chungag-Anye N B， Njamen D， Dongmo A B， et al. Anti-inflammatory and analgesic effects of Drypemolundein A， a sesquiterpene lactone from Drypetes molunduana[J]. Pharmaceutical Biology， 2002， 41（1）： 26-30.

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[7] Ngouela S， Ngoupayo J， Noungoue D T， et al. Gossweilone： a new podocarpane derivative from the stem bark of Drypetes gossweileri （Euphorbiaceae） [J]. Bulletin of the Chemical Society of Ethiopia， 2003， 17（2）： 181-184.

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