淮山組織培養(yǎng)抑制褐變的研究

潘梅+王景飛+黃賽+呂德任+戚華莎+符瑞侃

摘要：以淮山品種桂淮5號為供試材料，研究不同外植體、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基質(zhì)以及抗褐化劑等對淮山褐變的影響。結(jié)果表明，莖段外植體的褐變程度較輕，薯塊外植體的褐變程度嚴(yán)重；溫度和光照對褐變均有影響；液體培養(yǎng)的褐變程度較固體培養(yǎng)輕；在培養(yǎng)基中添加1.0 g/L活性炭，能夠有效抑制外植體的褐化，使褐化率降為70.37%，培養(yǎng)物能正常生長發(fā)育。

關(guān)鍵詞：淮山；組織培養(yǎng)；褐變；外植體；抗褐化劑

中圖分類號： Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）06-0057-03

收稿日期：2013-09-14

基金項目：海南省農(nóng)業(yè)科技示范推廣項目（編號：瓊農(nóng)計財[2012]48號）；海南省農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)項目（編號：瓊農(nóng)辦[2012]825）。

作者簡介：潘梅（1962—），女，廣西隆安人，高級園藝師，主要從事植物組織培養(yǎng)與開發(fā)利用研究。E-mail：panmei200@sina.com。

通信作者：符瑞侃，園藝師，主要從事藥用植物資源開發(fā)與利用研究。E-mail：fu0898@163.com?；瓷剑―ioscorea opposita）為薯蕷科薯蕷屬多年生草本植物，其塊根含有大量的蛋白質(zhì)、淀粉、維生素和有益的微量元素，目前已成為重要的國際性藥食兼用作物和珍稀蔬菜，市場需求量極大。在生產(chǎn)上，淮山主要利用薯塊和零余子制種繁殖，病蟲害較多，而且種性較易退化，產(chǎn)量和品質(zhì)難以保障。運用組織培養(yǎng)技術(shù)是繁育淮山良種最為有效的方法，不僅能夠解決淮山繁殖系數(shù)低及長期營養(yǎng)繁殖所造成的病毒病和品質(zhì)退化等問題，也是實現(xiàn)淮山產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。已有學(xué)者開展了淮山組織培養(yǎng)研究[1-10]，但在淮山組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象特別嚴(yán)重，影響培養(yǎng)物的生長發(fā)育，增殖率低，甚至導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡。褐化現(xiàn)象是影響淮山組織培養(yǎng)的一個關(guān)鍵因素，目前有關(guān)淮山組織培養(yǎng)快速繁殖中的褐化問題研究很少[11]。因此，本研究探討了淮山外植體類型、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基質(zhì)以及抗褐化劑類型等對淮山組織培養(yǎng)過程中外植體褐化的影響，以期為淮山組織培養(yǎng)快速繁殖提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗材料為淮山品種桂淮5號的薯塊及薯塊催生的幼嫩莖段。

1.2試驗方法

1.2.1外植體預(yù)處理切取薯塊和帶節(jié)莖段，在洗衣粉液中浸泡10 min后用流水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇表面消毒30 s，以無菌水沖冼2次后用0.1% HgCl2浸泡薯塊25 min、莖段8 min，最后用無菌水沖洗5次，薯塊切成約1 cm見方的小塊，莖段切成長約2 cm的帶節(jié)小段，接種到培養(yǎng)基中。

1.2.2培養(yǎng)基以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 g/L NAA作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所有培養(yǎng)基均含有30 g/L食用白糖，固體培養(yǎng)基添加6 g/L卡拉膠，pH值5.8。分裝好的培養(yǎng)基均經(jīng)121 ℃、0.14 MPa高溫高壓滅菌20 min。

1.2.3試驗設(shè)計（1）以薯塊和莖段2種類型的外植體進(jìn)行接種試驗，研究不同外植體類型的褐化反應(yīng)；（2）設(shè)置22、25、28、32 ℃ 4種溫度，研究不同溫度對外植體褐化的影響；（3）設(shè)置0、500、1 000、1 500、2 000、2 500 lx 6種光照強(qiáng)度，研究不同光照強(qiáng)度對外植體褐化的影響；（4）培養(yǎng)基中添加 200 mg/L 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、300 mg/L聚乙烯吡咯烷酮、200 mg/L半胱氨酸、200 mg/L抗壞血酸、1.0 g/L活性炭，研究不同抗褐化劑對外植體褐化的影響；（5）設(shè)置添加6 g/L卡拉膠的固體培養(yǎng)基和未加卡拉膠的液體培養(yǎng)基（搖床轉(zhuǎn)速為100 r/min）進(jìn)行外植體接種，觀察培養(yǎng)過程中的褐化情況，研究不同培養(yǎng)基質(zhì)對外植體褐化的影響。

試驗項（1）～（4）采用10 cm×10 cm的聚丙烯透明薄膜袋作為培養(yǎng)容器，試驗項（5）以直徑6 cm、高9 cm的玻璃瓶為培養(yǎng)容器，所有處理均接種60袋（瓶），每袋（瓶）1個外植體，分別在接種后的10、20、30 d觀察外植體的褐化情況和生長情況，所有數(shù)據(jù)均為培養(yǎng)30 d的結(jié)果。

1.2.4培養(yǎng)條件無特別說明，培養(yǎng)溫度均為25 ℃，光照強(qiáng)度為1 500 lx，光照時間為8 h/d。

1.2.5統(tǒng)計方法依據(jù)培養(yǎng)袋中培養(yǎng)基的褐化直徑將褐化程度分為4個等級：（1）無褐化。培養(yǎng)基中未出現(xiàn)褐色。（2）輕度褐化。培養(yǎng)基褐色直徑<2 cm。（3）中度褐化。培養(yǎng)基褐色直徑2～5 cm。（4）重度褐化。培養(yǎng)基褐色直徑>5 cm，外植體枯死（圖1-A ）。

褐化率=褐化外植體數(shù)/（接種外植體總數(shù)-被污染的外植體數(shù)）×100%；各級褐化率=各級褐化數(shù)/（接種外植體總數(shù)-被污染的外植體數(shù)）×100%；中度及以上褐化率=中度褐化率+重度褐化率。

2結(jié)果與分析

2.1淮山不同外植體的褐化反應(yīng)

2種外植體接種后3 d后均開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，培養(yǎng)30 d所有外植體基部培養(yǎng)基均出現(xiàn)不同程度的褐化。由表1可知，2種外植體褐化程度不同，莖段外植體的褐化程度相對較

褐化率（%）莖段07.8429.4162.7592.16薯塊02.046.1291.8497.96

輕，輕度和中度褐化率合計為37.25%，重度褐化率為6275%；而薯塊外植體的褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，培養(yǎng)基大面積出現(xiàn)黑褐色，輕度、中度褐化率合計僅占8.16%，而重度褐化率高達(dá)91.84%，比莖段外植體高出29.09百分點。這可能是因為薯塊本身所含酚類物質(zhì)較多，加之接種前切成塊狀，損傷面較大，損傷面細(xì)胞中的酚類物質(zhì)與氧氣聚合發(fā)生氧化反應(yīng)，形成較多的有毒醌類物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中[11]。

可以看出，隨著培養(yǎng)溫度升高，外植體褐化率加大，當(dāng)溫度達(dá)到28 ℃時，外植體全部出現(xiàn)褐化現(xiàn)象；褐化程度也隨著溫度升高而加重，表現(xiàn)為輕度褐化的比例逐漸減少，重度褐化的比例逐漸加大。當(dāng)溫度為22 ℃時，中度及以上褐化率最低，為80.70%，25、28 ℃時分別為89.09%、94.44%，而當(dāng)溫度達(dá)到32 ℃時，中度及以上褐化率最高，達(dá)到96.23%，可見溫度對淮山褐化的影響較大。因為淮山的生長要求溫暖氣候，25～28 ℃為其最適宜溫度范圍[10]，所以培養(yǎng)室溫度不宜過低。根據(jù)試驗結(jié)果及淮山生長適宜溫度要求，淮山組織培養(yǎng)的溫度以25 ℃為宜。

不同培養(yǎng)溫度對外植體褐化的影響

培養(yǎng)溫度

（℃）無褐化率

（%）輕度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）223.51 15.7928.0752.6380.70251.829.0918.1870.9189.092805.5622.2272.2294.443203.7716.9879.2596.23

2.3不同光照強(qiáng)度對外植體褐化的影響

由表3可見，外植體的褐化隨著光照強(qiáng)度增強(qiáng)而加重，在0～1 000 lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，少量外植體未出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，褐化程度較輕，中度及以上褐化率為78.85%～88.89%；當(dāng)光照強(qiáng)度在1 500、2 000 lx時，中度及以上褐化率相差不大，分別為92.85%、94.55%；當(dāng)光照強(qiáng)度達(dá)到3 000 lx時，中度及以上褐化率達(dá)到100%。因此，綜合考慮外植體的褐化情況以及生長所需的光照，淮山組織培養(yǎng)光照強(qiáng)度以1 500～2 000 lx 為宜。

表3不同光照強(qiáng)度對外植體褐化的影響

光照強(qiáng)度

（lx）無褐化率

（%）輕度褐化

率（%）中度褐化

率（%）重度褐化

率（%）中度及以上

褐化率（%）07.6913.4623.0855.7778.855005.5611.1016.6766.6783.341 0001.859.2618.5270.3788.891 50007.1523.2169.6492.852 00005.4523.6470.9194.553 0000024.5375.47100

2.4不同抗褐化劑對外植體褐化的影響

從表4可知，4種抗褐化劑均能不同程度地抑制外植體的褐化，中度及以上褐化率均低于對照處理。外植體在添加4種抗褐化劑的培養(yǎng)基中都能正常生長，月增殖倍數(shù)均大于對照處理。培養(yǎng)10～15 d，4種抗褐化劑的抑制效果較明顯，但隨著培養(yǎng)時間延長，各處理的褐化現(xiàn)象均越來越重，所有處理外植體基部培養(yǎng)基均有全部褐化的現(xiàn)象，只是數(shù)量不同。加入活性炭的處理對外植體褐化的抑制效果最好，外植體初始褐化時間為5 d，比其他4種抗褐化劑處理晚2 d，褐化率最低，為70.37%，而且褐化程度最輕，外植體基部培養(yǎng)基褐化直徑小于2 cm的占51.85%，重度褐化率僅為185%，中度及以上褐化率為18.52%。PVP處理對外植體褐化的抑制效果居于第二，且高濃度PVP優(yōu)于低濃度PVP。半胱氨酸和抗壞血酸2種處理對外植體褐化的抑制效果較差，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%。因此，在培養(yǎng)基中添加活性炭對外植體褐化的抑制起到了良好的作用。

2.5不同培養(yǎng)基質(zhì)對外植體褐化的影響

本試驗中外植體褐化現(xiàn)象在2種基質(zhì)中的

不同抗褐化劑對外植體褐化的影響

抗褐化劑無褐化

率（%）輕度褐

化率（%）中度褐

化率（%）重度褐

化率（%）中度及以上

褐化率（%）200 mg/L PVP3.7012.9627.7855.5683.34300 mg/L PVP5.3623.2130.3641.0771.43200 mg/L半胱氨酸5.088.4717.069.4586.45200 mg/L抗壞血酸1.827.2721.8169.1090.911 g/L活性炭29.6351.8516.671.8518.52對照06.6727.5065.8393.33

表現(xiàn)差別較大，固體培養(yǎng)基中褐化程度明顯大于液體培養(yǎng)基，其初始褐化時間早，出現(xiàn)枯死株，抽生芽生長狀況差。固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d開始出現(xiàn)褐化，培養(yǎng)10 d時，所有外植體基部的固體培養(yǎng)基均出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，以外植體基部為中心，培養(yǎng)基褐化直徑1～2 cm的占75.93%，3～4 cm的占24.07%；培養(yǎng)時間延至30 d時，72.22%的外植體基部培養(yǎng)基褐化直徑達(dá)到了5 cm左右，組培苗莖節(jié)數(shù)少且較為細(xì)弱。液體培養(yǎng)方式培養(yǎng)8 d時培養(yǎng)液開始出現(xiàn)褐色，10 d后培養(yǎng)液變?yōu)闇\褐色，培養(yǎng)時間達(dá)到30 d后，培養(yǎng)液變?yōu)樯詈稚庵搀w生長狀況良好，分化芽苗多而粗壯，最多達(dá)到12芽，平均增殖倍數(shù)為5.11，比固體培養(yǎng)方式高2.24。可能是因為外植體溢出的有毒物質(zhì)在液體中可以很快擴(kuò)散而被稀釋，短時間內(nèi)無法形成一個有效作用濃度點，因而對外植體造成的傷害較輕。因此，液體培養(yǎng)方式比固體培養(yǎng)方式更適宜淮山的快速繁殖。

不同培養(yǎng)基質(zhì)對外植體褐化的影響

培養(yǎng)基質(zhì)初始褐化

時間（d）枯化株數(shù)

（株）增殖倍數(shù)生長狀況固體培養(yǎng)基322.87較細(xì)弱液體培養(yǎng)基805.11粗壯

3結(jié)論與討論

3.1不同外植體的褐化程度不同

本試驗結(jié)果表明，莖段外植體的褐化程度較薯塊外植體輕，該結(jié)果與蔡建榮的研究結(jié)果[11]一致?；瓷降慕M織培養(yǎng)以莖段作為外植體較適宜。

3.2溫度、光照對褐化均有影響

本試驗中，隨著培養(yǎng)溫度升高和光照強(qiáng)度加強(qiáng)，外植體的褐化程度加重，溫度為25 ℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 lx時，外植體褐化較輕并能正常生長?；瓷酵庵搀w低溫和暗處理的褐化率最低，褐化程度最小，因為酚類化合物合成和氧化過程中有許多酶系統(tǒng)參與，而酶系統(tǒng)的活性受溫度和光照影響。高溫和光照會提高酶的活性，促進(jìn)培養(yǎng)組織中酚類物質(zhì)氧化，加速外植體褐化，因此在低溫、黑暗或遮光條件下培養(yǎng)外植體可以降低多酚氧化酶的活性，減少酚類氧化，從而減輕褐化。外植體的生長發(fā)育需要適宜的溫度和光照，應(yīng)以能降低外植體褐化而又不影響其正常生長的范圍為宜。

3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關(guān)?；钚蕴亢蚉VP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應(yīng)，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質(zhì)從外植體周圍吸附掉?；钚蕴砍擞形阶饔猛?，在一定程度上還降低了光照強(qiáng)度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結(jié)果與蔡建榮的研究結(jié)果有所不同，蔡建榮認(rèn)為PVP抑制褐化的效果優(yōu)于活性碳[11]，該結(jié)果的差異可能與試驗材料不同有關(guān)。

3.4液體基質(zhì)較固體基質(zhì)褐化輕

本試驗結(jié)果表明，淮山組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基質(zhì)為不加卡拉膠的液體培養(yǎng)基，能有效預(yù)防褐化，提高成活率，培養(yǎng)物生長快且繁殖系數(shù)大，但由于液體培養(yǎng)需要特別的設(shè)備，并不適宜進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，只適宜前期的誘導(dǎo)培養(yǎng)和初始培養(yǎng)材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應(yīng)以固體培養(yǎng)基質(zhì)為主。

3.5淮山的褐化現(xiàn)象難以完全抑制

本研究結(jié)果表明，在淮山的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物的褐化現(xiàn)象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑以及調(diào)控培養(yǎng)條件能更有效地降低培養(yǎng)物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養(yǎng)物能正常生長發(fā)育。

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3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關(guān)?；钚蕴亢蚉VP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應(yīng)，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質(zhì)從外植體周圍吸附掉?；钚蕴砍擞形阶饔猛猓谝欢ǔ潭壬线€降低了光照強(qiáng)度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結(jié)果與蔡建榮的研究結(jié)果有所不同，蔡建榮認(rèn)為PVP抑制褐化的效果優(yōu)于活性碳[11]，該結(jié)果的差異可能與試驗材料不同有關(guān)。

3.4液體基質(zhì)較固體基質(zhì)褐化輕

本試驗結(jié)果表明，淮山組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基質(zhì)為不加卡拉膠的液體培養(yǎng)基，能有效預(yù)防褐化，提高成活率，培養(yǎng)物生長快且繁殖系數(shù)大，但由于液體培養(yǎng)需要特別的設(shè)備，并不適宜進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，只適宜前期的誘導(dǎo)培養(yǎng)和初始培養(yǎng)材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應(yīng)以固體培養(yǎng)基質(zhì)為主。

3.5淮山的褐化現(xiàn)象難以完全抑制

本研究結(jié)果表明，在淮山的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物的褐化現(xiàn)象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑以及調(diào)控培養(yǎng)條件能更有效地降低培養(yǎng)物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養(yǎng)物能正常生長發(fā)育。

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[12]程廣有. 名優(yōu)花卉組織培養(yǎng)技術(shù)[M]

3.3不同抗褐化劑對褐化的影響差異大

本試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加1 g/L活性炭抑制褐化的效果最好，褐化率比對照下降近30%，且褐化程度多在中度以下，中度及以上褐化率僅為18.52%；300 mg/L PVP抑制褐化的效果次之，中度及以上褐化率為71.43%；而半胱氨酸和抗壞血酸抑制褐化效果不顯著，中度及以上褐化率分別為86.45%、90.91%，這也許與添加的濃度較低有關(guān)?；钚蕴亢蚉VP都是吸附劑，可以去除酚類氧化物造成的毒害效應(yīng)，它們的主要作用在于通過氫鍵、范德華力等作用力把有毒物質(zhì)從外植體周圍吸附掉?；钚蕴砍擞形阶饔猛?，在一定程度上還降低了光照強(qiáng)度，從兩方面減輕了褐變[12]。本試驗結(jié)果與蔡建榮的研究結(jié)果有所不同，蔡建榮認(rèn)為PVP抑制褐化的效果優(yōu)于活性碳[11]，該結(jié)果的差異可能與試驗材料不同有關(guān)。

3.4液體基質(zhì)較固體基質(zhì)褐化輕

本試驗結(jié)果表明，淮山組織培養(yǎng)的最適培養(yǎng)基質(zhì)為不加卡拉膠的液體培養(yǎng)基，能有效預(yù)防褐化，提高成活率，培養(yǎng)物生長快且繁殖系數(shù)大，但由于液體培養(yǎng)需要特別的設(shè)備，并不適宜進(jìn)行大規(guī)模的培養(yǎng)，只適宜前期的誘導(dǎo)培養(yǎng)和初始培養(yǎng)材料較少時使用，故淮山的組培育苗仍應(yīng)以固體培養(yǎng)基質(zhì)為主。

3.5淮山的褐化現(xiàn)象難以完全抑制

本研究結(jié)果表明，在淮山的組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)物的褐化現(xiàn)象不能完全控制，單因素措施在一定程度上可以控制淮山的褐化程度，采用綜合措施在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑以及調(diào)控培養(yǎng)條件能更有效地降低培養(yǎng)物的褐化率和褐化程度，不影響組織的生長和芽的分化，使培養(yǎng)物能正常生長發(fā)育。

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