影響油棕葉片愈傷組織誘導(dǎo)因素研究

鄒積鑫　尤麗莉　林位夫

摘 要 研究不同取材部位、激素組合配比等因素對(duì)3個(gè)不同油棕品系葉片愈傷組織培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明：不同部位的油棕葉片以及不同品系的油棕愈傷組織誘導(dǎo)存在極顯著差異；試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基+5 mg/L 2，4-D+10 mg/L TDZ+6 g/L瓊脂+30 g/L糖配比獲得較好的愈傷誘導(dǎo)率；添加2%活性炭可以有效抑制油棕葉片愈傷組織褐化。

關(guān)鍵詞 油棕 ；葉片 ；愈傷組織

分類號(hào) S564+.6

Some Factors Affecting Callus Induction from Oil Palm Leaves

ZOU Jixin1） YOU Lili2） LIN Weifu1）

（1 Rubber Research Institute， CATAS， Danzhou， Hainan 571737；

2 Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract Different parts of leaves and hormone combinations involved in oil palm leave callus culture for three strains of oil palm were studied. The result indicated that different parts of leaves and different strains of oil palm have significant difference in callus induction. The optimum medium components for oil palm callus induction were Murashige-Skoog （MS） medium supplemented with 5 mg·L-12，4-D and 10 mg/L TDZ and 6 g/L agar and 30 g/L sucrose. The supplying of 2% charcoal can prevent explants from browning efficiently.

Keywords oil palm ；leaves ； callus

油棕（Elaeis guineensis Jacg.）為棕櫚科（Palmae）油棕屬（Elaeis）常綠高大喬木，原產(chǎn)于熱帶非洲，是世界最重要的木本油料作物，被譽(yù)為“世界油王”，廣泛栽培于南緯10°至北緯15°之間的熱帶地區(qū)，是世界第一大木本油料作物。近年來(lái)，隨著油棕組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷深入開展，油棕的組培苗表現(xiàn)出良好的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀，與常規(guī)種子繁育的油棕品系相比具有明顯的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，逐漸被認(rèn)可和應(yīng)用，是世界油棕種苗產(chǎn)業(yè)未來(lái)發(fā)展的新方向[1]。國(guó)外的油棕組織培養(yǎng)技術(shù)研究開始較早也比較深入，1970年Staritsky[2]和Rabechault等[3]首次通過(guò)油棕種子胚獲得了油棕再生植株；1976年Rabechault等[4]通過(guò)油棕葉片獲得再生植株。目前在馬來(lái)西亞、印度尼西亞、哥斯達(dá)黎加等國(guó)家已經(jīng)有油棕組織苗的商業(yè)化生產(chǎn)[5-7]。由于油棕組織培養(yǎng)技術(shù)難度大又具有較高的商業(yè)價(jià)值，該技術(shù)已成為商業(yè)機(jī)密，極少公開報(bào)道。國(guó)內(nèi)龔崢等[8]于1987年開展了油棕組織培養(yǎng)的研究，分別以葉片和種胚誘導(dǎo)獲得油棕愈傷組織，但未見獲得完整油棕植株的報(bào)道。油棕葉片的初代誘導(dǎo)啟動(dòng)比較慢、愈傷組織誘導(dǎo)率較低、重復(fù)性較差。為建立高效的油棕組織培養(yǎng)體系，本研究以油棕葉片為外植體材料，探討了葉片的不同位置、不同品系、基本培養(yǎng)基和激素的不同配比等因素對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響，成功獲得高質(zhì)量的油棕愈傷組織，為建立高效油棕組織培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所油棕種質(zhì)圃樹齡約10年的油棕單株，包括RYL2、RYL4、RYL6三種油棕品系單株。

1.2 方法

1.2.1 材料前處理

選擇連續(xù)1周內(nèi)天氣晴朗的日子采集油棕葉片。取材前將油棕樹一側(cè)的葉片清理干凈，在油棕生長(zhǎng)點(diǎn)上方用鏟刀將油棕芯部取下，剝除外側(cè)葉柄并用75%的酒精對(duì)表面進(jìn)行消毒處理，充分干燥之后將其裝入干燥封閉的容器內(nèi)，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2.2 油棕外植體葉片的消毒處理

將采集得到的外植體材料用洗衣粉清洗表面，再用大量的自來(lái)水沖洗30 min，接著用75%的酒精擦洗外部及兩端切口，置于超凈工作臺(tái)上，再用75%酒精擦洗2 min后，剝?nèi)ゴ瓮鈱樱勒沾朔椒▽訉酉竞罅羧⌒静枯^嫩的葉片供接種。先用接種刀將葉片切分成8～10 cm的小段，再將葉片小段切分成1 cm×2 cm的薄片備用。

1.2.3 不同部位的油棕葉片對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

以油棕莖干切面中心點(diǎn)為起點(diǎn)，沿螺旋方向標(biāo)記不同部位的油棕葉片，最中心的葉片標(biāo)記為0號(hào)，依次標(biāo)記0～12號(hào)，將不同編號(hào)的葉片分別接種到MS+5mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+6 g/L瓊脂+30 g/L糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃。每6～7 d觀察1次，每2個(gè)月繼代1次，培養(yǎng)12個(gè)月后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況。每處理50瓶材料，重復(fù)3次。

1.2.4 不同品系油棕葉片對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

選取RYL2、RYL4、RYL6三個(gè)油棕品系各1株，采集油棕嫩葉，選擇生理狀態(tài)較為一致的油棕葉片接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。本試驗(yàn)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以MS為基本培養(yǎng)基附加如下不同濃度激素的2，4-D，NAA，TDZ，各處理編號(hào)依次為OPC1～OPC9，具體情況詳見表1。endprint

以上培養(yǎng)均在暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，每隔6～7 d進(jìn)行觀察記錄，每2個(gè)月繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)12個(gè)月后統(tǒng)計(jì)油棕葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況，每處理50瓶材料，重復(fù)3次。

1.2.5 不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)誘導(dǎo)油棕愈傷組織的影響

選擇生理狀態(tài)較一致的油棕葉片，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)為基本培養(yǎng)基MS附加一定濃度的2，4-D、NAA、TDZ，其中2，4-D濃度水平分別為2、5、10、20 mg/L，NAA濃度水平分別為1、5、10、15 mg/L，TDZ濃度水平分別為2、5、10、20 mg/L，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)24個(gè)處理，編號(hào)依次為OPC3 1～OPC3 24。以上培養(yǎng)在暗培養(yǎng)條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃，每隔6～7 d進(jìn)行觀察記錄，每2個(gè)月繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)12個(gè)月后統(tǒng)計(jì)油棕葉片愈傷組織的誘導(dǎo)情況，每處理50瓶材料，重復(fù)3次。

1.2.6 活性炭、抗壞血酸對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中褐化的影響

在配方為MS+5 mg/L 2，4-D +10 mg/L TDZ+30 g/L糖的基礎(chǔ)上分別添加不同濃度的活性炭、抗壞血酸，將油棕葉片接種到不同處理的培養(yǎng)基上，其中添加活性炭為0.1%，0.2%，0.5%三個(gè)水平，編號(hào)OPM4 1，OPM4 2，OPM4 3；添加抗壞血酸為0.1%，0.2%，0.5%三個(gè)水平，編號(hào)OPM4 4，OPM4 5，OPM4 6，培養(yǎng)條件為暗培養(yǎng)，溫度為（28±1）℃，每5 d觀察記錄，2個(gè)月后統(tǒng)計(jì)褐變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位的油棕葉片對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同部位的油棕葉片愈傷組織出愈率見表2。從表2可以看出，不同部位的油棕葉片愈傷組織出愈率在1.33%～24.67%，最高的部位在7號(hào)區(qū)域，最低的部位在12號(hào)區(qū)域。試驗(yàn)結(jié)果表明，編號(hào)為3～9區(qū)域的葉片最適合愈傷組織培養(yǎng)，不同部位的油棕葉片由于其生理狀況不同，而導(dǎo)致愈傷組織誘導(dǎo)的情況存在明顯的差異，通過(guò)DPS軟件統(tǒng)計(jì)分析其p值=1.87×10-11<0.01，差異極顯著。

2.2 不同品系油棕葉片對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

表3的試驗(yàn)結(jié)果表明，不同品系油棕愈傷組織誘導(dǎo)率，在不同種類和濃度的植物外源激素誘導(dǎo)條件下存在差異，其中誘導(dǎo)率最高的是處理OPC2，達(dá)到28.67%，最低的是處理OPC4和處理OPC8，為3.33%。通過(guò)DPS軟件進(jìn)行極差分析，結(jié)果表明，TDZ在3個(gè)水平、4個(gè)因素中極差最大，是主要影響因素，NAA排第二，2，4-D排第三，相對(duì)于激素的種類和濃度來(lái)說(shuō)，品系是最小的影響因子，這說(shuō)明影響不同品系油棕愈傷組織誘導(dǎo)最主要的因素是所采用的激素類型。

2.3 不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)誘導(dǎo)油棕愈傷組織的影響

從表4可以看出，隨著植物外源激素含量的增加，油棕葉片愈傷組織誘導(dǎo)率呈不斷提高的趨勢(shì)，但過(guò)高的激素濃度組合會(huì)降低油棕愈傷組織誘導(dǎo)率。其中最高的誘導(dǎo)率為23號(hào)組合，即5 mg/L 2，4-D與10 mg/L TDZ的配比，獲得油棕愈傷組織出愈率為46.00%；最低為6號(hào)組合，出愈率為5.33%。在試驗(yàn)設(shè)置的濃度配比中，在其中1種激素一定的情況下，另1種不同濃度激素處理間存在極顯著差異，p值在（0.002～1.5）×10-6<0.01，但是在2，4-D濃度為5 mg/L時(shí)，不同濃度的TDZ處理間p值=0.015>0.01，存在顯著差異，因此2，4-D在該濃度下可能對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的作用較為明顯。從表4還可以看出，在植物激素不斷提高的情況下，雖然總愈傷組織的誘導(dǎo)率提高，但胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率降低，非胚性的愈傷組織增多。在試驗(yàn)中也可以觀察到，過(guò)高的植物激素使油棕的愈傷組織根化，出現(xiàn)了一些不正常的形態(tài)，如圖1～3所示。

2.4 活性炭、抗壞血酸對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)中褐化的影響

根據(jù)表5的試驗(yàn)結(jié)果，在油棕葉片愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，添加一定濃度的活性炭可有效降低培養(yǎng)物的褐變程度（圖4）。當(dāng)添加1%的活性炭時(shí)，愈傷組織褐化程度明顯低于對(duì)照處理和添加抗壞血酸的處理，1%、2%、5%三個(gè)處理間對(duì)抑制褐變的效果差別不大。同時(shí)添加活性炭處理的愈傷組織誘導(dǎo)率要高于添加抗壞血酸處理以及對(duì)照的，說(shuō)明活性炭有助于油棕愈傷組織的誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

3.1 外植體材料對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

油棕組織培養(yǎng)的研究始于20世紀(jì)70年代，關(guān)于油棕外植體材料的選擇，國(guó)內(nèi)外均進(jìn)行了大量的研究。Wahid等[9]分別利用油棕的種胚、根、葉、花成功獲得了油棕愈傷組織，但目前運(yùn)用最廣泛的也是商業(yè)化程度最高的仍然是采用油棕的嫩葉作為外植體材料[10]。因?yàn)槭紫龋捎玫挠妥厝~片被包裹在油棕莖干里面，基本上是無(wú)菌的，消毒非常容易；其次，葉片屬于植物的體細(xì)胞，通過(guò)葉片細(xì)胞誘導(dǎo)愈傷組織獲得再生植株，可以完全遺傳親本的性狀，后代不會(huì)變異；第三，油棕葉片采集比較方便，1～2年即可恢復(fù)生長(zhǎng)，可以多次利用。

利用油棕體細(xì)胞進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)與利用種子胚誘導(dǎo)相比是非常困難的，這是因?yàn)榉N子胚中細(xì)胞的分化程度遠(yuǎn)小于體細(xì)胞，加上葉片的不同位置其生理狀態(tài)不同，葉片的分化程度也不一致，這也直接決定了其愈傷組織誘導(dǎo)成功的比例。

3.2 外源激素對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

植物激素是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的一個(gè)關(guān)鍵因素，這主要是由于植物激素在植物組織培養(yǎng)中的累積現(xiàn)象及后效作用而影響下代分化，通常以很低的濃度就可以產(chǎn)生很大的作用，但在油棕初代培養(yǎng)階段，所采用的植物激素濃度較其他植物的培養(yǎng)高出很多倍，這可能是由于油棕體細(xì)胞本身對(duì)某些植物激素的響應(yīng)程度較低造成的，也是油棕體細(xì)胞愈傷組織誘導(dǎo)的一個(gè)特點(diǎn)。但是較高的濃度，也會(huì)存在后代變異的風(fēng)險(xiǎn)。有報(bào)道指出，油棕組培后代在開花和結(jié)果時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一定比例的變異情況，造成油棕的減產(chǎn)[11]，可能是由于油棕初代誘導(dǎo)時(shí)過(guò)高的激素濃度造成的。因此，在油棕愈傷組織誘導(dǎo)階段，植物外源激素種類和濃度的選擇，值得深入探討和研究。國(guó)內(nèi)外在油棕愈傷組織誘導(dǎo)階段采用的激素種類很多，包括2，4-D，NAA，TCPP，Di等。本研究使用了TDZ、2，4-D和NAA 3種植物激素進(jìn)行研究，這3種激素在作用效果上表現(xiàn)為TDZ>2，4-D>NAA，效果好的植物激素其所需濃度相對(duì)較低，培養(yǎng)的結(jié)果也比較理想，但關(guān)于培養(yǎng)后期對(duì)油棕組培苗變異程度的影響還有待進(jìn)一步的觀察。endprint

3.3 活性炭對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

褐化是組培過(guò)程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對(duì)外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)影響較大。本研究通過(guò)添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時(shí)也能吸附其他物質(zhì)。從試驗(yàn)的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導(dǎo)形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時(shí)還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導(dǎo)，因此活性炭非褐變率和誘導(dǎo)率都高于抗壞血酸。但是過(guò)高的活性炭，在高溫下會(huì)水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

參考文獻(xiàn)

[1] Soh A C， Wong G， Tang C C， et al. Recent advances towards commercial production of elite oil palm clones， Palm Oil Congr.， 2001[C]. Kuala Lumpur： Malaysian Palm Oil Board， 2001.

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[4] Rabéchault H， Martin J P. Multiplication végétative du palmier a huile（Elaeis guineensis Jacq.） a l'aide de cultures de tissus folaires[J]. CRAcad Sci Paris， 1976， 283（16）： 1 735-1 737.

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[7] Guzman N， Peralta F. Advances in tissue culture propagation of compact Oil palm clones in Costa Rica[J]. ASD Oil palm Papers， 2010， 35： 1-12.

[8] 龔 崢， 崔元方， 陳幸華， 等. 油棕葉片愈傷組織endprint

3.3 活性炭對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

褐化是組培過(guò)程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對(duì)外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)影響較大。本研究通過(guò)添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時(shí)也能吸附其他物質(zhì)。從試驗(yàn)的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導(dǎo)形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時(shí)還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導(dǎo)，因此活性炭非褐變率和誘導(dǎo)率都高于抗壞血酸。但是過(guò)高的活性炭，在高溫下會(huì)水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

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[8] 龔 崢， 崔元方， 陳幸華， 等. 油棕葉片愈傷組織endprint

3.3 活性炭對(duì)油棕愈傷組織誘導(dǎo)的影響

褐化是組培過(guò)程中外植體內(nèi)的酚類物質(zhì)在有氧氣的條件下，被多酚氧化酶氧化形成有毒的醌類物質(zhì)，聚合形成黑褐色物質(zhì)擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，使外植體切面迅速變成褐色，抑制其他酶的活性，對(duì)外植體產(chǎn)生毒害的現(xiàn)象。在木本植物組織培養(yǎng)中褐化現(xiàn)象更為普遍，由于油棕葉片內(nèi)酚類物質(zhì)含量及多酚氧化酶活性較高，因此容易發(fā)生褐化現(xiàn)象，對(duì)試驗(yàn)影響較大。本研究通過(guò)添加活性炭和抗壞血酸等物質(zhì)，有效地降低了外植體的褐化現(xiàn)象。

活性炭不僅能夠吸附有毒物質(zhì)，同時(shí)也能吸附其他物質(zhì)。從試驗(yàn)的結(jié)果可知，在油棕愈傷組織誘導(dǎo)形成中，不僅產(chǎn)生多酚等物質(zhì)，同時(shí)還有其他未知的代謝產(chǎn)物可能影響油棕愈傷組織的誘導(dǎo)，因此活性炭非褐變率和誘導(dǎo)率都高于抗壞血酸。但是過(guò)高的活性炭，在高溫下會(huì)水解培養(yǎng)基中的蔗糖，使培養(yǎng)基pH改變，導(dǎo)致培養(yǎng)基不凝固。因此選用2%的添加濃度比較理想。

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