靈芝液體深層發(fā)酵技術(shù)研究進(jìn)展

屈直++謝晴宜++馬海霞

摘 要 靈芝是我國著名的藥食兼用大型真菌。對近年來靈芝液體深層發(fā)酵技術(shù)在菌種選育、培養(yǎng)基優(yōu)化以及發(fā)酵參數(shù)選擇等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)闡述。

關(guān)鍵詞 靈芝 ；液體深層發(fā)酵技術(shù) ；研究進(jìn)展

分類號 Q939.97

Recent Advances in Liquid Submerged Fermentation Technology of

Ganoderma lucidum

QU Zhi XIE Qingyi MA Haixia

（Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS， Hainan 571101， China）

Abstract Ganoderma lucidum is famous for the medicinal fungi and new food resources. The recent advances in research on the stain improvement， medium optimization and the fermentation parameters selection were briefly introduced， as well as the prospect for the development of liquid submerged fermentation technology of Ganoderma lucidum.

Keywords Ganoderma lucidum ； liquid submerged fermentation ； research progress

靈芝（Ganoderma lucidum），俗稱赤芝、紅芝、木靈芝，古稱瑞草，是我國著名的藥食兼用大型真菌，其孢子、菌絲和子實(shí)體均可利用，藥用歷史悠久，古典醫(yī)書對靈芝的藥用功效均有記載，認(rèn)為靈芝是祛病延年、滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本、有利于機(jī)體保持或恢復(fù)穩(wěn)態(tài)的珍貴藥品，可用于多種疾病的治療[1]。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝中已經(jīng)分離到150 余種化合物，其中主要的生理活性物質(zhì)為靈芝多糖和靈芝三萜，它們具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、抗氧化、消炎抗菌、保肝護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)新陳代謝等功效，且?guī)缀鯚o毒副作用，受到醫(yī)藥界的廣泛重視。傳統(tǒng)上，靈芝是通過野外采集或人工栽培獲得。目前，靈芝野生資源稀缺，而人工栽培投入成本高，生長周期長（2～3個月以上），勞動強(qiáng)度大，易受季節(jié)、環(huán)境、區(qū)域、原料等因素制約，品質(zhì)難以控制[2-3]；此外，傳統(tǒng)上靈芝以子實(shí)體或孢子入藥，子實(shí)體味苦，木質(zhì)化、纖維化程度高，孢子細(xì)胞壁厚，機(jī)體較難吸收利用，不宜直接用作食、藥原料[4]。1973年，林忠平等[5]以靈芝、紫芝為試驗(yàn)材料，進(jìn)行了一系列液體深層發(fā)酵技術(shù)的相關(guān)研究，此后，國內(nèi)外學(xué)者相繼展開了對液體深層發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用研究與探討，其培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟和完善。與傳統(tǒng)方法相比，該技術(shù)具有周期短、成本低、產(chǎn)出多、利于工業(yè)化、培養(yǎng)物營養(yǎng)豐富且質(zhì)量穩(wěn)定，以及提取分離容易等優(yōu)點(diǎn)，而且靈芝深層培養(yǎng)液苦味小，營養(yǎng)和藥用價值不低于子實(shí)體甚至有些指標(biāo)高于子實(shí)體。液體深層發(fā)酵生產(chǎn)靈芝已顯示出明顯的優(yōu)勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 菌種選育研究

優(yōu)良菌種的選育是提高靈芝液體深層發(fā)酵水平的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。目前，常用的育種手段有自然選育、誘變育種和雜交育種。從野生靈芝經(jīng)組織分離、純化所獲得的菌株，對自身固有的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)較為依賴，趨于穩(wěn)定生長和繁殖，長速慢，生產(chǎn)能力低，無法為液體深層發(fā)酵提供其所需的大量靈芝菌種[6]。從現(xiàn)有研究來看，采取孢子、原生質(zhì)體等誘變育種仍是靈芝菌種選育主要途徑。朱芬等[7]在對供試靈芝菌株進(jìn)行原生質(zhì)體紫外誘變的基礎(chǔ)上，經(jīng)過多重篩選試驗(yàn)，獲得了菌絲干重和三萜含量穩(wěn)定提高的誘變株UV-3。董玉瑋等[8]采用氯化鋰誘變赤靈芝原生質(zhì)體，所得誘變株液體發(fā)酵目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量有較大提高。董玉瑋等[9]采用紫外線與甲基磺酸乙酯、紫外線與氯化鋰復(fù)合誘變靈芝原生質(zhì)體，所得誘變株胞外多糖產(chǎn)量較原發(fā)菌株分別提高49.75%和57.87%，遺傳穩(wěn)定性較好。王淑珍等[10]對靈芝孢子進(jìn)行紫外線與60CO-γ射線交替積累誘變處理，所得誘變株菌絲生長速度快，菌絲積累量、遺傳穩(wěn)定性均較好。李穎穎等[11]、謝瑀婷等[12]通過低能N+離子注入方法誘變靈芝孢子，取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果。隨著遺傳學(xué)、生物化學(xué)、微生物學(xué)等學(xué)科的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程等已應(yīng)用到靈芝育種中。高明俠等[13]采用原生質(zhì)體電融合技術(shù)選育高產(chǎn)多糖菌株，所得融合株的生物量和多糖含量均高于親本菌株。李剛等[14]建立了通過PEG轉(zhuǎn)化緩沖液將外源基因轉(zhuǎn)入靈芝的方法，為通過基因工程手段定向、快速改良靈芝藥用品質(zhì)以及利用靈芝發(fā)酵方法生產(chǎn)一些具有重大經(jīng)濟(jì)價值的外源蛋白等應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

此外，靈芝深層發(fā)酵優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)菌株的篩選研究已開展較多，通過綜合比較分析菌絲生長速度、菌絲體生物量及目標(biāo)產(chǎn)物含量等指標(biāo)選育出適應(yīng)性強(qiáng)、遺傳性狀穩(wěn)定、目的產(chǎn)物得率高的優(yōu)勢菌株。王磊等[15]比較了8 個靈芝菌株的菌絲生長速度、菌絲體生物量及多糖含量等指標(biāo)，篩選出優(yōu)勢菌株。宋頻然等[16]運(yùn)用反饋抑制理論構(gòu)建了耐靈芝胞外多糖（EPS）反饋抑制的篩選模型，并用其篩選37株靈芝菌株，最終檢出耐靈芝胞外多糖反饋抑制作用最強(qiáng)、產(chǎn)胞外多糖能力最強(qiáng)的菌株GL029。余素萍等[17]通過搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)，從22個靈芝菌株中篩選出三萜高產(chǎn)菌株GL31。王雁萍等[18]應(yīng)用添加亞硒酸鈉（Na2SeO3）的培養(yǎng)基篩選富硒能力較強(qiáng)、菌體生物量及菌體多糖產(chǎn)量均較高的菌株。

2 培養(yǎng)基優(yōu)化

目前，已有較多學(xué)者對靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基成份進(jìn)行了優(yōu)化研究，但是由于各研究的供試菌株及原材料有所不同，因此培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果也不盡相同，無法進(jìn)行相互比較。endprint

2.1 碳源

靈芝液體發(fā)酵所需的碳源來源廣泛，常見的有葡萄糖、蔗糖、果糖、乳糖、麥芽糖、玉米粉等。董元榮[19]開展了靈芝液體發(fā)酵所需碳源的篩選試驗(yàn)，指出玉米粉為最佳碳源。余以剛等[20]研究了碳源對靈芝液態(tài)發(fā)酵的影響。結(jié)果表明，紅芝對單糖、雙糖和多糖均能較好地利用，其中以葡萄糖為碳源時得到的生物量和胞外粗多糖產(chǎn)量最多。劉冬等[21]對15 種常用碳源進(jìn)行篩選研究，發(fā)現(xiàn)最適碳源單糖為葡萄糖，二糖為蔗糖，多糖為玉米粉、小麥面粉、麩皮粉或土豆粉，靈芝菌絲體的長速以在葡萄糖為碳源的液體培養(yǎng)基中最快，蔗糖次之，多糖最慢。此外，一般認(rèn)為復(fù)合有機(jī)碳源更有利于靈芝菌及其次生代謝產(chǎn)物的生成。李平作等[22]研究顯示，除葡萄糖外，在培養(yǎng)基中添加組分較復(fù)雜且富含半纖維素、纖維素的復(fù)合碳源如玉米粉、酒糟等可獲得較好的發(fā)酵效果。復(fù)合碳源具有原料來源廣泛易得、成本低廉的優(yōu)勢，適應(yīng)產(chǎn)業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)的需求。

2.2 氮源

氮源主要是合成靈芝真菌細(xì)胞合成核酸、蛋白質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ)。劉冬等[21]報道，用酵母膏、黃豆餅粉、花生餅粉、蛋白胨等有機(jī)氮源進(jìn)行靈芝液體發(fā)酵時，菌絲體的產(chǎn)量明顯高于無機(jī)氮源，可見靈芝菌絲體對有機(jī)氮源的利用能力要優(yōu)于無機(jī)氮源。Hsieh CY[23]研究表明，蛋白胨和酵母提取物對于靈芝菌絲的生長刺激作用顯著，但加入量過高會抑制細(xì)胞的生長和產(chǎn)量。常景玲[24]報道，將麩皮（5%）和蛋白胨（0.3%）搭配作為氮源，比單一的麩皮或蛋白胨作為氮源對菌絲體與多糖的產(chǎn)生更有利。

2.3 碳源、氮源濃度及碳氮比（C/N）

培養(yǎng)基的優(yōu)化，除考量碳、氮源的組成外，碳、氮源濃度及合適的碳氮比也是需要著重考慮的。只有二者均在合適的濃度下，菌絲體才能兼顧生長和次生代謝產(chǎn)物的形成。李平作等[25]報道，較高的C/N有利于靈芝多糖的生成；在C/N確定時，太高的碳源濃度對菌絲體生長存在抑制作用，影響發(fā)酵周期；氮源濃度對發(fā)酵的周期影響不大，但對靈芝多糖及靈芝酸的產(chǎn)量是有影響的。劉冬等[21]研究認(rèn)為，最佳碳氮比為23.6～31.1。Babitskaya[26]研究表明，當(dāng)碳氮比值于18.0～25.0時，對多糖的生成最為有利。Hsieh CY[23]試驗(yàn)證實(shí)，充分的碳源供給是保證菌絲體中多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵。羅建成等[27]報道，靈芝菌絲體生物量和胞外多糖含量在一定的范圍內(nèi)隨著葡萄糖含量增加而升高，但當(dāng)葡萄糖含量大于5%時，靈芝菌絲體的生長將受到抑制。黃達(dá)明等[28]對碳源、氮源的篩選結(jié)果顯示，含有酮基的碳源、氮源要優(yōu)于不含酮基的，且只有在一定的碳氮源濃度范圍內(nèi)才能較好地合成靈芝酸。

2.4 無機(jī)鹽

靈芝在液體深層發(fā)酵過程中需要添加少量的無機(jī)鹽，如磷、鉀、鎂、硫和鈣等，菌絲生長的最基本元素為磷、鉀和鎂，磷參與糖代謝，鎂離子參與菌體生長，鉀對糖酵解有促進(jìn)作用。劉冬等[21]報道，培養(yǎng)基中Mg2+、P5+缺乏對菌絲體生物量影響較大，而K+缺乏時菌絲體幾乎不生長。Hsieh CY[23]研究發(fā)現(xiàn)，磷酸鹽缺乏可導(dǎo)致胞內(nèi)多糖產(chǎn)量顯著降低，而限量添加Mg2+則會獲得較低含量的大分子多糖。其它一些無機(jī)鹽，如鈣離子，一般使用碳酸鈣調(diào)節(jié)發(fā)酵液酸堿度；硒和鋅等元素，靈芝可將這些無機(jī)態(tài)的礦質(zhì)元素生物富集，進(jìn)而轉(zhuǎn)化成有機(jī)態(tài)的礦質(zhì)元素，更易于人體吸收。魏賽金等[29]探討了在培養(yǎng)基中添加不同濃度的鋅離子對靈芝菌絲生長和液體發(fā)酵富集Zn2+的影響。胡志斌等[30]就不同水平亞硒酸鈉對靈芝液體發(fā)酵的影響進(jìn)行了研究，數(shù)據(jù)顯示液體發(fā)酵培養(yǎng)基中硒濃度為250 μg/mL時獲得的菌絲體生物量最高。

2.5 生長因子

靈芝液體培養(yǎng)需要一定量維生素類物質(zhì)，特別是維生素VB1（硫胺素），它在靈芝生長過程中不能自己合成，必需從外界補(bǔ)充，對靈芝菌絲體生長和生物活性物質(zhì)生成有著重要作用。劉冬等[21]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，缺乏VB1、VB2對菌絲體生長有部分影響。胡煥榮[31]認(rèn)為，在培養(yǎng)基中加入150 mg/L VB1，能促使靈芝菌絲體生長粗壯。陳芳莉等[32]探討了維生素與靈芝菌絲體生長及其胞外多糖生成間的關(guān)系，結(jié)果表明，VB2與VB6對菌絲體生長均有促進(jìn)作用，且可使其生成較多的胞外多糖，VB2較VB6作用更為明顯。另據(jù)陳志玲等[33]報道，液體培養(yǎng)時加入適量的復(fù)合VB、VB1、鐵和鋅可使靈芝多糖及靈芝酸產(chǎn)量顯著地提高。

2.6 非必需營養(yǎng)因子

據(jù)有關(guān)報道，不同脂肪酸類物質(zhì)、醇類及中藥提取物對靈芝液體深層發(fā)酵也有著不同的影響。Yang FC等[34]研究顯示，脂肪酸對靈芝菌絲體生長及次生代謝產(chǎn)物形成等有一定的影響。Yang HL等[35]研究認(rèn)為，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中添加甲醇、乙醇和1-丙醇能使多糖產(chǎn)量分別提高1.0、2.4和1.8 倍。劉媛等[36]報道，在培養(yǎng)基中添加金銀花、淡豆豉、淡竹葉、連翹和甘草等對靈芝菌絲體生長及靈芝酸生成均有一定的促進(jìn)作用；薄荷和蘆根能促進(jìn)靈芝菌絲體生長，但不能促進(jìn)靈芝酸生成。

3 發(fā)酵條件控制

靈芝液體深層發(fā)酵的目的是要得到高生物量及高產(chǎn)量的次生代謝產(chǎn)物；但在實(shí)際發(fā)酵過程中，二者難以同時達(dá)到高產(chǎn)，故此，要根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要選擇有利于目標(biāo)產(chǎn)物生成的發(fā)酵條件。

3.1 培養(yǎng)溫度

靈芝屬高溫型真菌，其深層發(fā)酵的溫度范圍較廣，在22～35℃內(nèi)都可以生長。Babitskaya[26]報道，最適于供試菌株菌絲體生長和靈芝多糖積累的溫度范圍在25～30℃，低于25℃或高于30℃菌絲體生物量和靈芝多糖含量則顯著減少。Chang MY等[37]在研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝液體發(fā)酵的最適溫度為34℃。綜上所述，最適溫度因不同情況而有所不同，存在一定的差異性，這可能與菌種本身及其它發(fā)酵因素（如培養(yǎng)基成分、pH值等）共同引起的。

3.2 pH值endprint

液體發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的pH值對菌絲體生長也存在較大的影響，過酸或過堿對靈芝菌絲體的生長都是不利的；pH值也是影響次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的重要因素，其變化會導(dǎo)致各種酶活性的改變，從而影響次生代謝產(chǎn)物的形成。李平作等[37]研究顯示，適合于多糖形成的pH值與適合于菌絲生長的pH值并不一致。Fang QH等[39]針對液體發(fā)酵初始pH值對菌絲體生物量及其生物活性物質(zhì)含量的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果表明初始pH值為6.5時，生物量和靈芝酸含量達(dá)到最高；而當(dāng)初始pH值下降時，靈芝多糖含量隨之上升。Kim等[40]認(rèn)為，靈芝發(fā)酵過程中分段控制pH值也是提高胞內(nèi)多糖與胞外多糖的有效方法。凌慶枝等[41]試驗(yàn)證明，pH值與菌絲生長、胞內(nèi)外靈芝酸及胞外多糖生成緊密相關(guān)，菌絲生長及胞內(nèi)靈芝酸形成最適pH值是5.5，胞外多糖形成最適pH值是4.6，胞外靈芝酸形成最適pH值是4.5。

3.3 培養(yǎng)時間

靈芝的液體深層發(fā)酵首先是搖瓶培養(yǎng)得到種子液，然后在發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)獲得大量的次生代謝產(chǎn)物。楊炎等[42]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，赤芝G2在液體深層發(fā)酵前32 h處于生長延滯期，生物量增加很小，而在發(fā)酵76 h生物量達(dá)到最高。余素萍等[43]研究顯示，菌絲中三萜類物質(zhì)主要在培養(yǎng)后期大量生成，但并非培養(yǎng)時間越長，其含量就越高。培養(yǎng)至一定時間后，三萜類物質(zhì)減少或只在組分間相對比例上有所變化。Yang FC等[44]報道，供試菌株在2 L發(fā)酵罐中進(jìn)行液體發(fā)酵時，靈芝多糖含量從第2 d開始呈S型曲線上升，至第5 d達(dá)到最高濃度，且開始趨于穩(wěn)定；此外，發(fā)酵罐中靈芝多糖的產(chǎn)出與通氣量還有著較大的關(guān)系。因此，實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物來選擇適宜的培養(yǎng)時間。

3.4 種齡和接種量

生長旺盛、活力強(qiáng)的種子是菌絲體的生長和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的基礎(chǔ)。一般認(rèn)為，處于對數(shù)生長中期的種子更有利于菌絲體的生長，搖瓶種子液的培養(yǎng)周期確定為3 d左右較好。

接種量的多少關(guān)系到菌絲體的生長、形態(tài)進(jìn)而影響其次生代謝產(chǎn)物的生成。Fang QH等[45]認(rèn)為，接種量干重在330 mg/L時，菌絲體干重可達(dá)到最高；當(dāng)接種量干重在70～670 mg/L時，接種量減少，菌球直徑變大，靈芝酸含量增多；接種量增加，菌球直徑變小，多糖含量增多。由此可以看出，較低的接種量有利于靈芝酸的產(chǎn)生；而高的接種量有利于靈芝多糖的產(chǎn)生。楊炎等[42]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種量的確定應(yīng)綜合培養(yǎng)周期和培養(yǎng)基的利用率，定為10%較為適宜。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，應(yīng)隨其它發(fā)酵條件的設(shè)置而所有差別，可根據(jù)所需的有效組分控制接種量。

3.5 振蕩頻率、轉(zhuǎn)速及溶氧

靈芝是好氧真菌，氧氣供給不足會抑制其生長代謝。種子液搖瓶培養(yǎng)時的振蕩頻率和發(fā)酵罐發(fā)酵時的轉(zhuǎn)速與通氣量，都和溶氧緊密相關(guān)。李平作等[46]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在25 L發(fā)酵罐內(nèi)選擇180 r/min的轉(zhuǎn)速和1∶0.75 v/v·m的通氣量效果較好，較高的轉(zhuǎn)速可致菌絲球較小，但有利于胞內(nèi)多糖的形成[22]。Tang YJ等[47]報道低溶解氧（10%左右）時，菌絲體生長受阻，但胞外多糖和胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量卻高于溶解氧25%時的產(chǎn)量；除此還發(fā)現(xiàn)，初始體積溶氧系數(shù)（KLa）較高時可得到高生物量和高胞內(nèi)多糖產(chǎn)量，當(dāng)KLa再增加時，菌絲球直徑增大，發(fā)酵10 d后得到的靈芝酸產(chǎn)量較高。另據(jù)報道，在靈芝液體發(fā)酵過程中，其菌絲體生長與胞外多糖生成所需要的最適溶氧是基本一致的，均在 80%左右，超過這一水平，對胞外多糖的生成不利[48]。

4 展望

采用液體深層發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)靈芝，在一定程度上克服了采收野生靈芝和栽培靈芝的局限性。此外，該技術(shù)可在短時間內(nèi)制備出的大量的優(yōu)質(zhì)液體菌種，縮短制備原種和栽培種時間，便于工廠大規(guī)模生產(chǎn)；通過發(fā)酵又可分泌得到大量的胞外活性物質(zhì)，將其用于研究開發(fā)保健食品、保健藥品和治療藥物等。這些都極大地推動了液體深層發(fā)酵技術(shù)在靈芝中的應(yīng)用。目前，學(xué)者們在優(yōu)良菌株的選育、培養(yǎng)基的篩選、培養(yǎng)條件的優(yōu)化、發(fā)酵工藝的改良等方面都進(jìn)行了有益的探索，提高了靈芝液體深層發(fā)酵的技術(shù)水平，但在研究和生產(chǎn)中仍存在著一定的問題，如發(fā)酵培養(yǎng)基和工藝條件適用性不廣、菌種質(zhì)量要求高、不同規(guī)模發(fā)酵結(jié)果差異較大、發(fā)酵過程易染菌、難以確定發(fā)酵終點(diǎn)、適于發(fā)酵工業(yè)的品種比較少、次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量還無法同子實(shí)體相比等。今后應(yīng)從以下幾個方面加強(qiáng)研究：加強(qiáng)最適發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件的篩選和優(yōu)化；采用理化誘變、原生質(zhì)體融合和基因工程等方法選育優(yōu)良菌種；找出發(fā)酵規(guī)模不同而致發(fā)酵結(jié)果差異的主要原因，設(shè)法縮小其差異；提高對發(fā)酵過程動態(tài)監(jiān)控水平；改善液體工藝條件和發(fā)酵設(shè)備；根據(jù)不同的發(fā)酵目的和發(fā)酵工藝，綜合考慮經(jīng)濟(jì)、產(chǎn)品質(zhì)量等因素，確定發(fā)酵終點(diǎn)等。隨著靈芝液體深層發(fā)酵研究的系統(tǒng)和深入及各種生物反應(yīng)器的研制成功，必將提高靈芝的發(fā)酵水平和資源利用效率，促進(jìn)靈芝在醫(yī)藥食品等領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用。

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